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两文一综述!PNAS连续重磅!RNAi技术又上一层楼!

首页 » 《转》译 2018-03-23 转化医学网 赞(2)
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导读
RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。近几年来RNAi研究取得了突破性进展,由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。2018年伊始,《PNAS》连发两论文一综述,让RNAi的研究更加如火如荼。
呈递问题的解决

  在RNAi过程中,特殊的酶能将RNA切成小片段(siRNA或miRNA),并与特殊的蛋白(Argonaute蛋白,尤其是Argonaute 2(Ago2)蛋白)相结合,从而抑制靶向信使RNA翻译。siRNA药物可以在特定基因水平上起作用,可以递送到胞质溶胶中,并且不需要运输到细胞核中或与染色体DNA相互作用。然而,正如其他DNA和RNA候选药物一样,siRNA药物也正面临着无法进行有效呈递的问题。这些大分子会被体液中的核酸酶迅速降解,并且经历肾脏和肝脏的快速清除,严重的有可能引发不利的先天性免疫反应,想要提高siRNA药物的疗效和安全性,首要解决的就是呈递问题。




  Jiahe Li带领的研究团队借助不同的传递载体,以RNAi的中央效应蛋白Argonaute 2(Ago2)为平台增强RNAi。他们发现siRNA和Ago2之间的物理聚集对于RNAi的增强不可或缺。同时他们还发现某些聚胺可调节siRNA / Ago2介导的RNA,他们借此使致癌基因STAT3沉默并显着延长了黑素瘤小鼠的存活率。该研究结果以《Structurally modulated codelivery of siRNA and Argonaute 2 for enhanced RNA interference》为题发表于2月5日的《PNAS》上。


  siRNA / Ago2进入细胞示意图


  Li等将双链siRNA和Ago2蛋白包装到具有相同骨架但聚乙烯二胺重复不同的聚胺的阳离子侧基上。研究人员发现,在哺乳动物细胞中,与其他三种Argonaute蛋白相比,Ago2显得更为重要。在RNA诱导的基因沉默复合物形成和mRNA翻译时,siRNA的载体链被切割并从Ago2分离,而反义siRNA链加载的Ago2却可持续识别并切割靶mRNA。这项研究结果为改进RNAi技术功效提供了新方法。



  siRNA / Ago2引起的基因沉默

  siRNA / Ago2聚胺引起的基因沉默


  研究人员对聚胺合成的呈递载体的设计参数和由此产生的siRNA / Ago2的基因沉默效率进行了研究,并合成了一系列衍生自L-天冬氨酸苄酯骨架和N-羧酸酐的聚合物,这种聚合物主链已被证明是相对安全的,侧链为多胺结构,这些适当的侧链操作不仅实现了高效率呈递,还阻止了负面影响的产生。这些研究表明,再编码的Ago2在基因沉默中发挥的重要作用,可以以不同的方式调节基因。尽管这些影响目前归因于聚合物和siRNA以及Ago2之间的物理作用,但是这些研究结果将引导科学家对纳米级效应机制的详细研究,并对siRNA在体内稳定性的研究会有所帮助。另外,研究人员发现优化的多胺/抗STAT3 siRNA / Ago2复合物可使肿瘤负荷降低并使小鼠存活率改善,这表明结构优化的siRNA / Ago2具有治疗的潜力。


  多胺侧链结构稳定了siRNA和Ago2之间的纳米级相互作用


特异性问题的解决

  虽然CRISPR技术能够达到永久改造基因的效果,但在许多疾病中沉默基因会建立短期效应,其在mRNA水平上的基因表达无法完全阻断,还会减少相应的目标效应。想要准确识别这些短期效应,就需要具有极强特异性的工具,解决RNAi技术的特异性问题已经迫在眉睫。




  在3月12日一篇题为《Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute》的文章中,Audrone Lapinaite等人将焦点聚集于Argonaute(Ago) 蛋白上。研究人员发现,使用5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)体外重建的CRISPR相关的Ago复合物Marinitoga piezophila Argonaute-gRNA(MpAgo RNP)可显着增强其对RNA靶标的特异性和亲和力。他们借此绘制了gRNA的种子区域,并鉴定出决定其靶向特异性的gRNA的核苷酸。

  在一些细菌中,Agos与CRISPR基因座相关,并使用非经典的5'-羟基化的指导RNA(gRNA)进行核酸靶向。研究人员发现MpAgo很容易用gRNA编程来形成RNA-蛋白质复合物(RNP)。重建的MpAgo RNPs只能以中等的亲和力和特异性结合完全互补的RNA底物,在gRNA的5'末端掺入5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)后,使MpAgo RNP快速稳定,并大大提高了MpAgo RNP的亲和力和特异性。此外,具有5'-BrdU gRNA的MpAgo RNP可选择性结合仅相差一个核苷酸的底物,实现了从复杂的混合物中分离出肌苷编辑的RNA底物。这些发现拓宽了研究人员对Ago与底物RNA相互作用的机理理解,并证明MpAgo RNP可以用作高度特异性的RNA靶向平台来研究RNA。




  具有5'-BrdU gRNA的MpAgo RNP特异性结合ssRNA


gRNA的种子区域


  另外,研究人员测试了gRNA的5'端核苷酸是否影响MpAgo RNP结合和切割RNA的能力。他们使用与gRNA完全互补或非互补的RNA底物,检查了gRNA的5'-末端核苷酸是否影响体外ssRNA亚基结合效率和特异性。研究结果表明高效切割不需要ssRNA底物的紧密结合,gRNA的5'端核苷酸也不影响MpAgo RNP的结合能力。他们借此绘制了gRNA的种子区域,并鉴定出决定其靶向特异性的gRNA的核苷酸,顺利解决了RNAi疗法的特异性问题。




  3月16日,Rangaramanujam M. Kannan发表了题为《Toward new design principles for superior gene silencing》的综述,对上述研究做了相应分析。文中指出,通过明确的设计原则,改进的siRNA包装,可以有效解决siRNA的呈递和Ago蛋白的特异性问题,为RNAi疗法开辟新的途径,从而实现个性化的精准药物。


  参考资料:

  1. Structurally modulated codelivery of siRNA and Argonaute 2 for enhanced RNA interference

      2. Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute

      3. Toward new design principles for superior gene silencing

        (转化医学网360zhyx.com)

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