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2017,最优质的CRISPR基因编辑技术突破盘点

首页 » 《转》译 2017-12-15 转化医学网 赞(3)
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导读
CRISPR基因编辑技术,用任何赞美字词去称赞它都不为过。它为人类打开了新世界的大门,也开启了人类编制生命之网的历程。那么在过去的2017年,到底诞生了哪些优秀的成果呢?

2003年的一个闷热的下午,正在度假的西班牙微生物学家Francisco Mojica告诉他的妻子,他不打算回家了。多年来, Mojica一直在从事CRISPR研究,引导他进入这个研究领域的是一次偶然的发现:一个神秘的细菌DNA片段被插入了其他病毒的序列。


这个不归家的下午,后来成就了超过2000篇的文章,其中包括《Nature》、《Science》、《Cell》等顶级期刊的发表的文章。


Mojica博士和同事们偶然发现了一种古老的细菌性免疫防御系统,可以储存病毒的基因密码,如果将该系统比作警察,那它手里就有罪犯——病毒DNA的照片,那么任何之前侵略过该细菌的病毒会被立马清除出去。


这一发现可不可以被用于编辑其他基因呢?可以。


2012年, Emmanuelle Charpentier博士(柏林感染生物学Max普朗克协会的成员)和Jennifer Doudna博士(伯克利大学霍华德休斯医学研究所的教授)的合作,证明了CRISPR系统(使用一种名为Cas9核酸酶)作为一种有效的基因编辑工具,能够定位和切割几乎任何DNA序列。


现在张锋博士和George Church博士如果能够证明CRISPR/Cas9可以编辑人体内的基因,那么生物技术的革命暴风雨,将瞬间席卷全世界。


在过去的6个月中,我们看到了人类胚胎致病基因编辑的重大进展,包括基因编辑工具的拓展:RNA编辑器、CRISPR系统和超精密的基础编辑系统。


那么在2017年,有哪些巅峰的CRISPR编辑系统的进展,值得我们在这一年的年尾反复回味呢?


1.Malorye Allison Branca——CRISPR系统将改变临床的格局


2017年2月份,《Nature》子刊指出CRISPR编辑与测序技术相结合,可以大大提升遗传筛查的效率。


3月份,《Nature》发表斯隆凯特林癌症纪念中心的论文,利用CRISPR编辑构建强效CAR-T细胞研究论文,实现肿瘤的超强杀灭效果。


而如果说起基因编辑技术,就不得不提中国。2016年10月四川大学的Lu You 教授第一个进行了CRISPR实验,他在肺癌患者的肺中注入能够降低PD-1活性的免疫细胞。虽然实验结果有效性被颇多人质疑,但是毫无疑问,这是一项创举。



CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1是目前广泛使用的基因编辑系统。目前来看,CRISPR临床前研究的结果振奋人心,例如血友病、杜氏营养不良症、眼部疾病或是甲状腺素运载蛋白淀粉样变性的治疗。

随着CRISPR基因编辑的技术发展,其应用于临床的前景必将无比宽阔。


2.DeeAnn Visk博士——基因编辑系统的装备库


扩大CRISPR/Cas9的规模需要进行相关的结果验证。最简单的方法就是设计相关的基因库或检测试剂盒,使得CRISPR/Cas9越来越成熟。


Vermeulen博士对CRISPR/Cas9进行多组实验后发现,CRISPR编辑技术可以永久修改基因组DNA而不是暂时改变RNA的表达水平。DNA的合成能力近年来突飞猛进,研究人员能合成更长的DNA并且可以进行质粒的组装,从而简化CRISPR基因库的制备。


ATI可以用来评估CRISPR诱发突变的细胞系。通过使用高活性的T7核酸内切酶及相应仪器可以加快CRISPR的实验进程。长片段的PCR扩增技术已被高度选择性的T7 DNA酶所取代。含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的启动子可以解决二倍体细胞系中两个DNA突变鉴别的问题。这种标记可以用来评价细胞中被替换基因的启动子强度。


3.Kate Marusina博士——怀疑论者的“毁灭帝”


在人类的感觉器官中,最容易受损的就是听力,而超过50%是遗传导致的。


为了对此进行研究,科研人员利用斑马鱼进行试验。听力受损的斑马鱼表现出一种特征性的循环游泳行为,以此来与野生型进行区分。研究人员利用基因编辑技术和转录激活因子核酸酶(TALENs),使得隐性纯合子的胚胎表达降低。而这个结果,大大减少了斑马鱼的遗传性听力损失。



4.MaryAnn Labant——基因编辑造福器官移植


利用CRISPR/Cas9技术,人类可以解决跨物种移植这个难题,解决人体组织器官的严重短缺。考虑到伦理和兼容性,器官移植一开始把重点放在猪的器官上。然而, 1997年发生的猪内源性逆转录病毒事件使得全球禁止进行猪器官的移植,人类将所有的希望集中在转基因猪上。随后科学家在PK15猪肾上皮细胞上进行了相关实验根除了猪内源性逆转录病毒。


Milliporesigma公司推出了各种CRISPR产品,为广大科研人员服务。milliporesigma和威康信托基金桑格研究所经过两年的合作,开发出了第一个基因组文库筛选系统,从而减少了实验的时间。



5.MaryAnn Labant——基因编辑路在何方


CRISPR-Cas9基因编辑系统相较于经典的基因治疗所需时间更短,且基因组编辑组件可以被加载到病毒载体中,加速临床开发。早期的基因组编辑使用的是锌指核酸酶的方法(ZFN)。而CRISPR-Cas9的出现为基因编辑注入了新的活力。但CRISPR-Cas9有一定的局限性,例如靶向性和特异性。CRISPR目前只是用来辅助治疗CAR-T细胞以增强其疗效。

那么现在,CRISPR基因编辑技术可以用来做什么?


基因组CRISPR筛选识别调控蛋白



利用CRISPR进行遗传筛选可以控制相关遗传物质。研究人员构建了由同一启动子表达的绿色荧光蛋白(GFP),然后在其中一组的细胞启动子和GFP之间插入了目标基因调控元件,另一个组则没有。在几个不同的时间点通过对两组细胞进行流式细胞仪分离细胞,检测相应的荧光强度。通过这一实验,我们能够筛选人类蛋白编码基因,并确定负责调控相关蛋白的调节基因。


CRISPR/Cas9能够加快HIV的筛查和治疗



多年来,高通量阵列基因组筛选技术一直是探究生物相关通路的标准,用来研究相应的生物学机制。CRISPR/Cas9的基因敲除技术具有高通量检测的优势,它能转化CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)与CRISPR RNA Cas9蛋白的合成和引物RNA。这项研究的重点是确定艾滋病毒感染的新靶点。通过表型、基因编辑率和基因敲除等方法验证了研究方法的准确性。作者在排除了几个宿主因子的影响后,证实了预期的表型,发现了新的基因靶点。因此,他们展示了利用CRISPR基因敲除筛选方法来确定HIV发病与新感染宿主之间的关系。


克服克隆筛选的瓶颈



CRISPR / CAS系统的瓶颈在于对含有致突变和杂合性的克隆体的测序。虽然可以用筛选方法加以解决,但成本和时间大大增加。目前,科学家们正在转向低成本的筛选方法。AATI已经开发出一个强大的T7核酸内切酶法,能够与片段分析仪无缝集成,用来对CRISPR基因编辑的精度进行测定。


高度特异的基因组编辑:alt-r S.P. HIFI Cas9核酸酶3nls



许多研究者关注的一个问题是CRISPR/Cas9系统潜在的脱靶效应。通过对alt-r CRISPR-Cas9 系统-alt-r化脓性链球菌HIFI Cas9核酸酶3nls进行高效基因组编辑后,其基因编辑效率和精度都大幅提升。IDT的科学家利用Cas9核酸酶使该系统变成更精确的基因组编辑工具。通过对250000多个突变体进行实验后,他们认为这种酶能有效解决脱靶现象的发生。它的优越性能已经得到了许多实验室的验证,这些实验室对各种生物系统进行了相应的转化研究。


1型糖尿病小鼠模型



杰克逊实验室的模型建立服务(MGS)团队已经广泛使用CRISPR技术创造转基因小鼠,他们建立的模型是B淋巴细胞的类开关重组突变体,这在研究1型糖尿病的发展中至关重要。研究人员使用经CRISPR处理过的双阴性Aidca基因小鼠与野生型小鼠进行比较,双阴性Aidca基因小鼠的1型糖尿病发病率更低。结果表明利用CRISPR 技术修改Aidca基因能够显著降低1型糖尿病的发生率。


CRISPR转染技术治疗多个单基因突变的艾滋病的发展



CRISPR是一个突破性的技术,但无论是在基础研究中或作为一种治疗剂,CRISPR基因编辑都必须进入相关的细胞群中才能发挥作用。因此在更为复杂的研究或是临床研究中,CRISPR转染细胞往往比较困难。MaxCyte是基于流式电穿孔技术的基因编辑器,它具有转染效率高和细胞存活率高的特点。


加快分析CRISPR/Cas9产品自动化编辑效率的测量



利用CRISPR/Cas9进行精确的基因修饰需要强大的分析工具来验证目标是否突变成功,并测量实验的效率。传统的CRISPR/Cas9分析的瓶颈是难以处理大剂量的样品。经典分析方法费时费力,不适于高通量分析。PerkinElmer芯片实验室的GX核酸分析仪采用相关的微电流技术,减少了样本测序的数量,大大缩短时间。


代理CRISPR实验



Milliporesigma具有高效的研发CRISPR功能实用性的能力。MilliporeSigma能使不具备DNA切割活性的dspCas9突变并将它放置在CRISPR系统附近,使其产生巨大的DNA切割活性。CRISPR代理实验可以提高三个方面的内容:(1)提高基因组编辑的能力,包括基因敲除和插入;(2)增加靶向性,成倍增加目标基因的靶向性;(3)降低目标基因的切割频率。


在更为自然的生物环境中进行蛋白质生物学研究



标记序列常常被整合到表达蛋白中,从而对蛋白质的功能进行鉴定。然而,许多大尺寸的标记物插入效率低,并且检测通常仅限于抗体层面,导致这些方法使用受限。Promega公司的科学家们通过一种11个氨基酸的肽标签敏感的生物发光检测方法,来克服CRISPR编辑的局限性。


我们已经不再为CRISPR编辑系统的突破感到惊讶,衷心希望这个领域的突破可以尽快推动到临床,帮助人类真正战胜各类遗传病。


参考资料:Supplement: Best of CRISPR 2017

Peak CRISPR: On the Cusp of a Biomedical Revolution


(转化医学网360zhyx.com)

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