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Nature子刊丨利用CRISPR技术治疗失明?新型Cas9酶或许能行!

首页 » 《转》译 2017-02-23 转化医学网 赞(2)
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导读
能够将基因组编辑工具CRISPR / Cas9包装成一个针对大量组织的递送系统是分子生物学家的目标。目前,基因组工程中心的科学家,与ToolGen和首尔国立大学合作,已经设计了最小的CRISPR / Cas9递送系统,通过腺相关病毒将其递送到肌肉细胞和眼睛,并用它来编辑引起失明的基因。新Cas9酶,预期成为对抗常见和不可排除的疾病靶标的有用的治疗工具,其源自空肠弯曲杆菌,空肠弯曲杆菌是导致食物中毒的常见原因。

能够将基因组编辑工具CRISPR / Cas9包装成一个针对大量组织的递送系统是分子生物学家的目标。目前,基因组工程中心的科学家,与ToolGen和首尔国立大学合作,已经设计了最小的CRISPR / Cas9递送系统,通过腺相关病毒将其递送到肌肉细胞和眼睛,并用它来编辑引起失明的基因。新Cas9酶,预期成为对抗常见和不可排除的疾病靶标的有用的治疗工具,其源自空肠弯曲杆菌,空肠弯曲杆菌是导致食物中毒的常见原因。

这项研究发现最近在Nature Communications上的一篇题为“InVivo Genome Editing with a Small Cas9 Orthologue Derived from Campylobacter jejuni”的文章中公开。

CRISPR / Cas9系统在分子生物学领域激发了众分子生物学家的想象力,是许多疾病分子治疗方案的真正来源。该技术是一种创新,便宜以及精确的基因编辑技术。CRISPR / Cas9工作时作为一对分子剪刀在目标基因上按照RNA指示的精确位置进行切割。然而,CRISPR / Cas9复合物到达其靶DNA,其必须通过质粒或病毒递送。

IBS基因组工程中心主任兼联合高级研究调查员Jin-Soo Kim博士解释说:“AAV是一种能够在体内表达特定携带基因的有效且安全的载体。

Cas9酶被几种细菌用作免疫武器,用来切割可能损害细菌的病毒DNA。最常见的CRISPR / Cas9技术使用来自化脓性链球菌的Cas9。然而,这个蛋白质由1368个氨基酸组成,由于分子量太大而不能被AAV递送包装。即使科学家把它分成两部分,每部分用不同的病毒包装,其他的问题也会出现。AAV需要递送双倍量的病毒,并且分裂的Cas9比完整的SpCas9活性低。多年来,研究人员已经发现了较小分子量的Cas9酶,例如来自金黄色葡萄球菌(1053个氨基酸)的酶。然而,虽然这个酶可以被AAV传递,但是它没有留下足够的空间以容纳其他必需蛋白。

在目前的研究中,研究小组发现,空肠弯曲杆菌的Cas9既有效分子量又小。其由984个氨基酸组成,它可以与多个导向RNA,以及荧光报告蛋白一起打包到AAV被传递。

文章作者写道:“目前最小的Cas9,来自空肠弯曲杆菌(CjCas9),可以在体内进行有效的基因组编辑。在确定间隔相邻基序(PAM)序列并优化单导向RNA(sgRNA)长度后,我们将CjCas9基因,其sgRNA序列和标记基因一同打包在AAV载体中并以高滴度产生所得病毒。 CjCas9是高度特异性的,仅切割人或小鼠基因组中有限位点。

为了使用细菌蛋白进行基因编辑,研究者不得不优化该技术的一些方面。他们设计了一个短的DNA序列,紧接着Cas9靶向的序列,称为间隔基序相邻基序(PAM)。每个不同的Cas9需要特定的PAM序列,否则将不能结合和切割靶DNA序列。此外,他们不得不修改导向RNA的长度。

一旦他们的修改完成,研究人员将新的CRISPR / Cas9复合物与两个导向RNA和荧光报告蛋白一起包装到AAV中,以在小鼠肌肉和眼睛中编辑基因。科学家将注意力集中在与年龄相关性黄斑变性(AMD)相关的两个基因,这两个基因是成年人失明的主要原因之一。一个基因是AMD的常见治疗靶标,称为血管内皮生长因子A(Vegfa),另一个是激活Vegfa转录的转录因子,其被称为Hif1a。

 “CjCas9通过AAV递送,在小鼠肌肉细胞或视网膜色素上皮(RPE)细胞中高频率诱导靶向突变,”作者指出。“此外,CjCas9靶向RPE细胞中的Vegfa或Hif1a基因,减少了激光诱导的脉络膜新血管形成的大小,表明用CjCas9进行体内基因组编辑是治疗年龄相关性黄斑变性的新选择。

Kim博士指出:“眼内注射AAV包装的CRISPR / CjCas9可有益于治疗各种视网膜疾病和全身性疾病。CjCas9是高度特异性的,并且不引起基因组中的脱靶突变。”

Hif1a基因靶序列在小鼠和人中都是相同的,从而本研究中提出的方法将来可用于治疗人类患者的AMD。CRISPR / CjCas9技术可以拓宽治疗靶点的范围,可能使整个人类基因组药物化。(转化医学网360zhyx.com)

Smallest CRISPR So Far Comes from Food Poisoning Bacteria


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