体内（in vivo）CAR-T的免疫原性分析策略

CAR-T（Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受体T细胞）疗法已成为难治复发血液恶性肿瘤治疗的高效手段，显著提升了患者的生存率，近年来其应用范围已逐步扩展至实体瘤和自身免疫性疾病[1]。目前已获批的CAR-T产品均为体外制备的个性化自体细胞疗法，但其复杂的制造流程、漫长的生产周期及高昂的成本，严重限制了患者可及性[2]。

图1 体外（ex vivo）与体内（in vivo）CAR-T疗法[2]

体内（in vivo）CAR-T疗法作为一种颠覆性策略，通过基因递送载体将编码CAR的转基因直接递送至患者体内内源性T细胞，实现原位重编程，无需单采血、体外细胞培养及清淋预处理，有效解决了传统体外CAR-T疗法的诸多弊端（图1）[3][4]。体内CAR-T兼具基因治疗与细胞治疗的双重属性，但由于其递送方式、载体类型及作用机制的特殊性，其免疫原性来源更复杂，影响因素更多样。

图2 AAV基因治疗相关免疫应答[5]

免疫原性是指抗原刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答的能力。特异性免疫应答，主要包括体液免疫应答和细胞免疫应答，前者主要产生抗药物抗体（ADA），后者主要激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。对于in vivo CAR-T，病毒载体和CAR分子均能引起体液免疫应答和细胞免疫应答（图2和3）。这些免疫应答不仅可能降低其在体内持久性和抗肿瘤功效，还可能引发严重的免疫相关不良反应，因此，在体内CAR-T临床试验中建立科学、系统的免疫原性分析策略，对保障疗法的安全性和有效性至关重要[6][7]。

图3 CAR-T的免疫原性[8]

一、体内CAR-T疗法免疫原性的主要来源

体内CAR-T疗法的免疫原性主要来源于CAR分子本身、基因递送载体及相关外源成分，其免疫应答的强度和类型与载体类型、CAR结构设计、递送方式及患者个体免疫状态密切相关，具体来源及特点如下。

1、CAR分子本身的免疫原性

CAR分子作为异源蛋白，其结构中的“非我”成分是引发免疫原性的核心来源。CAR分子通常由单链可变片段（scFv）、铰链区、跨膜区及胞内信号域组成，其中scFv多来源于鼠源抗体，即使经过人源化改造，仍可能保留部分异源序列，被患者免疫系统识别为外来抗原，进而引发免疫应答。此外，CAR分子的胞内信号域（如CD3ζ、4-1BB、CD28等）若存在序列修饰或异源片段，也可能增强免疫原性。

与体外CAR-T不同，体内CAR-T的CAR分子由载体在体内瞬时或持续表达，其表达水平、持续时间及组织分布均可能影响免疫原性强度。例如，LNP-mRNA载体介导的CAR分子为瞬时表达，其在体内的存在时间较短，可能降低长期免疫应答的风险；而病毒载体介导的CAR分子可持续表达，可能持续刺激免疫系统产生免疫应答。

2、基因递送载体的免疫原性

基因递送载体是体内CAR-T疗法的核心组成部分，主要分为病毒载体（如慢病毒载体LVs、腺相关病毒载体AAVs）和非病毒载体（如脂质纳米颗粒LNPs、聚合物纳米颗粒NPs），不同载体的免疫原性存在显著差异[2][9][10][11]。病毒载体凭借其较高的转导效率，成为体内CAR-T生成的重要平台，但病毒本身作为外源物质，极易诱发机体免疫反应[9]。慢病毒载体的包膜糖蛋白（如VSV-G）、腺相关病毒载体的衣壳蛋白，均可能被机体免疫系统识别，引发先天免疫应答和适应性免疫应答。例如，VSV-G可激活机体产生中和抗体，影响载体的转导效率和重复给药的有效性，同时可能引发I型干扰素介导的免疫激活，诱发CRS。非病毒载体（如LNP-mRNA）为体内CAR-T工程提供了病毒载体的变革性替代方案，其免疫原性相对较低，但仍可能引发一定的免疫应答。

二、体内CAR-T的免疫原性检测与分析的核心策略

体内CAR-T临床试验的免疫原性分析需遵循“全面覆盖、重点突出、动态监测、风险导向”的原则，结合疗法的载体类型、CAR结构及临床特点，构建涵盖免疫原性检测、结果解读、风险评估及应对措施的完整体系。

免疫原性检测方法的灵敏度、特异性和重复性，直接影响免疫原性分析结果的可靠性。需根据检测指标的特点，选择合适的检测方法，并结合体内CAR-T的特性进行针对性优化，确保检测结果能够准确反映机体的免疫应答状态。结合体内CAR-T疗法的载体类型、CAR表达特点及患者免疫状态，具体检测方法的选择与优化分体液免疫应答检测和细胞免疫应答检测两大类。

1、体液免疫应答检测

体液免疫应答的核心检测目标是针对体内CAR-T疗法中不同免疫原（载体、CAR表达产物）产生的特异性抗体，包括中和抗体，主要分为抗载体抗体检测和抗表达产物抗体（如抗CAR抗体）检测，需结合抗体类型选择适配检测平台，同时兼顾方法学合理性，确保检测结果精准可靠。

1.1 检测目标

抗载体抗体

（1）病毒载体（慢病毒、AAV）：重点关注载体结构蛋白，慢病毒主要检测针对包膜糖蛋白（如VSV-G）的抗体，AAV主要检测针对衣壳蛋白的抗体，这些蛋白是引发机体体液免疫应答的主要抗原位点。

（2）非病毒载体（LNP-mRNA）：重点关注LNP的成分（如PEG）、mRNA修饰片段及LNP表面靶向分子（如CD3、CD4、CD8靶向分子）。

抗表达产物抗体

重点关注表达产物CAR的免疫原性。抗CAR抗体是机体对体内原位表达的CAR分子产生的特异性抗体，是评估体液免疫应答对CAR-T细胞功能影响的核心指标。优先选择CAR分子的免疫优势位点作为检测对象，主要包括单链可变片段（scFv）、胞外铰链区，其中scFv（即使经过人源化改造）仍是主要免疫原性位点，需重点检测针对该区域的抗体。

1.2 检测方法

ELISA与电化学发光（ECL）法

ELISA与电化学发光（ECL）法是最常用的ADA检测方法。常用的方式是利用包被或结合在微孔板表面的免疫原性物质（如CAR分子、完整载体或载体组分）捕获样本中的对应的待测抗体（如抗CAR抗体、抗载体抗体），再加入底物（如四甲基联苯胺、含三丙胺的缓冲液）进行反应，最后在酶标仪、电化学发光分析仪等设备上进行信号检测，信号强度与待测抗体的量正相关[[12][19]。

基于细胞的流式细胞术（Cell-based flow cytometry）

使用表达CAR的细胞（如Jurkat T细胞或中国仓鼠卵巢（CHO）细胞）作为靶细胞，模拟CAR-T细胞表面的天然CAR构象；同时使用不表达CAR的野生型细胞作为阴性对照。将待测血清与两种细胞分别孵育，若存在抗CAR抗体，则结合于CAR细胞表面；随后加入荧光标记的二抗和活力染料，通过流式细胞术检测荧光强度（MFI）。通过CAR细胞与野生型细胞的MFI差值，特异性识别抗CAR抗体[20][21][22]。此方法中，CAR在细胞膜上可以以全长形式表达，保留了天然结构、翻译后修饰及与膜环境相互作用的能力，更接近体内真实状态，避免了重组蛋白可能存在的构象改变或表位遮蔽。不过流式细胞法操作步骤多、耗时长，且需同时处理两种细胞系和多组对照，在高通量样本筛查时，操作有难度。

转导抑制法

对于病毒载体，检测抗载体中和抗体可选用转导抑制法检测可以通过细胞法（图4）。将携带报告基因（如荧光素酶或GFP）的病毒载体与梯度稀释的患者血清预孵育，然后加入靶细胞（如HEK293细胞）进行转导。通过测量报告基因的表达水平（如发光或荧光强度），并与阴性对照比较，计算表达抑制程度。中和滴度通常定义为能够抑制50%报告基因表达的最高血清稀释度（ID50）。该方法直接反映了抗体及中和因子对病毒转导的功能性阻断作用[23]。

图4 转导抑制法[23]

2、细胞免疫应答检测

细胞免疫应答的核心检测指标为针对CAR分子、载体的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答，同时需辅助检测免疫细胞亚群变化、细胞因子分泌水平，全面评估细胞免疫应答的强度和功能。

2.1 核心检测指标：特异性T细胞应答检测

酶联免疫斑点实验（ELISpot）

ELISpot基于抗原特异性刺激→细胞因子捕获→酶促显色的原理，是检测抗原特异性T细胞频率的金标准方法[16][24][25][26][27][28][29]。将受试者的PBMC与CAR来源肽段（图5）在预包被了细胞因子（如IFN-γ）捕获抗体的微孔板里共孵育。如果受试者体内存在能够识别CAR来源肽段的宿主T细胞（即发生了“抗CAR”免疫反应），这些T细胞就会被激活并分泌IFN-γ等细胞因子，这些因子立即被抗体捕获。洗涤后加入生物素化的检测抗体，再通过酶（如HRP）标记的链霉亲和素与底物反应，在细胞分泌位点形成不溶性有色沉淀斑点。每个斑点代表一个能够识别CAR蛋白肽段的T细胞，通过斑点计数可计算出抗原特异性T细胞的频率（灵敏度可达1/105–1/106 PBMC）。

图5 ELISpot相关CAR-T肽段设计[24]

胞内细胞因子染色（ICS）与流式细胞术（FCM）

通过检测宿主T细胞是否识别CAR来源的肽段并发生功能性活化（IFN-γ分泌），来评估针对CAR-T药物的细胞免疫应答[30][31]。从患者外周血分离PBMC，加入CAR源肽段进行体外刺激，同时设置阳性对照和阴性对照。刺激后，通过固定破膜，使用荧光标记抗体对细胞表面标志（CD3、CD4、CD8）和胞内IFN-γ进行染色。利用流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞中IFN-γ阳性的比例。该方法可精准检测特异性CTL的比例和表型（如CD8+、CD4+ T细胞亚群），能够更全面地评估特异性T细胞应答。

细胞毒性实验

直接评估CTL对CAR阳性细胞或载体感染细胞的杀伤能力，可采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法、铬释放法、流式细胞术杀伤试验等，直观反映特异性T细胞的功能活性，为评估细胞免疫应答对CAR-T细胞的清除作用提供直接依据[32]。

体外增殖实验体外增殖实验可测定患者来源的T细胞在受到经辐照的CAR阳性靶细胞或CAR-肽混合物刺激后，体外环境下的增殖情况，从而检测针对CAR的特异性T细胞应答，通常通过³H-胸苷摄取法或流式细胞术评估（如使用琥珀酰亚胺酯羧基荧光素二乙酸酯等增殖染料的稀释法）[33]。

2.2 辅助检测指标：免疫细胞亚群及细胞因子检测

免疫细胞亚群检测：采用流式细胞术检测外周血中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞（Treg）、抗原呈递细胞（APCs）等亚群的比例变化，评估细胞免疫应答的整体状态，例如CD8+ T细胞比例升高、Treg细胞比例降低，提示细胞免疫应答激活。

细胞因子检测：采用多重细胞因子检测技术（如MSD multiplex assay、Luminex技术），检测外周血中IL-6、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的分泌水平，间接评估细胞免疫应答的强度，同时为判断是否诱发CRS等不良反应提供依据。另外，细胞因子也可作为药效生物标志物。

3、免疫原性结果的解读与临床关联分析

体内CAR-T临床试验中，免疫原性结果的解读需结合检测数据、临床疗效及安全性指标，进行综合分析，明确免疫原性与疗法有效性、安全性的关联，避免单一指标解读的局限性。

三、迈杰转化医学蛋白平台&国瑞怡康蛋白平台免疫原性检测解决方案

迈杰蛋白/生物分析中心具有定制化方法开发能力，针对单抗、双抗、融合蛋白、病毒、基因治疗、细胞治疗（图6和7）等不同类型药物，成功开发和验证过多个免疫原性检测方法，助力了申办方临床项目的顺利进行。蛋白平台的配置可满足各种需求，可灵活选择ELISA、MSD、细胞学功能中和等方法，并严格遵循ICH及FDA/NMPA指导原则。

图6 CAR-T项目ADA方法验证示例

迈杰蛋白/生物分析中心可以提供符合GLP、GCP、GCLP等质量规范的实验室分析检测服务，除了上述免疫原性检测外，还可提供生物标记物和大分子药代(PK)分析检测。已完成超过150种方法学的开发和验证，服务过各种药物类型的临床试验项目超200个。迈杰蛋白/生物分析中心拥有完善的质量管理体系、稳定的技术团队、丰富的项目经验，能够提供高质量服务。

图 7 CAR-T (BCMA) ADA方法验证部分数据展示

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