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总是被忽视的sgRNA，才是CRISPR基因编辑实验成功的关键！

首页 » 产业 » 快讯 2020-10-12 转化医学网赞(3)

导读	CRISPR/Cas9即成簇规律间隔的短回文重复序列与Cas9蛋白组成的系统是细菌抵御外来病毒侵染的免疫系统。现代生物学已将CRISPR/Cas9系统广泛应用在基因编辑领域。

瑞典当地时间10月7日，2020年诺贝尔化学奖授予了法国科学家Emmanuelle Charpentier和美国科学家Jennifer A. Doudna，以表彰其“开发了一种基因组编辑的方法”，阐述和发展了CRISPR基因编辑技术。

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas9 ) 即成簇规律间隔的短回文重复序列与Cas9蛋白组成的系统是细菌抵御外来病毒侵染的免疫系统。现代生物学已将CRISPR/Cas9系统广泛应用在基因编辑领域，是继锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)、转录激活样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)等技术后最为重要的基因改造技术，可以在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表观遗传修饰及3D基因结构改变中进行广泛的应用^[1]。

图1：The three stages of the CRISPR/Cas bacterial adaptive immune system: acquisition, crRNA biogenesis and interference of viral DNA^[2]

CRISPR/Cas9的应用

1、药物靶点的确定与验证

2、基因环路上下游调控机制分析

3、代谢通路调节机制分析

4、 LncRNA作用机制分析

CRISPR/Cas9基因编辑系统是包含单链RNA的sgRNA用与sgRNA的5'端互补的序列将Cas9蛋白引导至目标DNA位点。Cas9 Nuclease 对目标DNA序列的PAM依赖性识别并在PAM区上游3bp的特定位点启动DNA切割。Cas9 Nuclease 生成的双链断裂可通过NHEJ（Non-homologous end joining）或HDR（Homology directed repair）修复，NHEJ修复通常导致indel突变和基因失活，而HDR可以在提供供体模板时实现高保真的精确基因组编辑。由于生物体具有自我修复机制，随着细胞复制分裂并修复切口，在修复的过程可能产生错配，移码突变、缺失突变，最后筛选出错配纯合子。

图2：An overview of CRISPR/Cas9 mediated genome editing^[3]

CRISPR/Cas9 系统成功的关键包括

1）如何减少和避免脱靶：采用nick形式的Cas9加双链sgRNA2）sgRNA靶点的选择：Cas9 Nuclease 切割位置在待修饰位点的30bp以内，Z差保持在50bp以内。

3）sgRNA品质：sgRNA活性是影响KI的关键因素之一，因此需要提前验证其活性。

4）Cas9 Nuclease 形式的选择：缩短Cas9蛋白在细胞内的存续时间，可以避免连续切割和脱靶，建议使用mRNA或蛋白形式的Cas9。若采用质粒，需要确保其纯度和浓度（建议大于1μg/μl）。

……

翊圣生物经过匠心研发，开发出的sgRNA体外合成试剂盒利用其提供的试剂和使用者自己设计的特异性DNA序列，可在单管反应4小时内获得20-100μg具有功能的高品质的sgRNA，具有合成效率高、品质好、切除效率高等特点。

Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit测试数据

较高浓度的sgRNA关系到CRISPR/Cas9系统的编辑效果成败，因此只有加入高浓度的sgRNA方能对基因的编辑起较好效果。翊圣开发出的sgRNA体外合成试剂盒利用其提供的试剂和使用者自己设计的特异性DNA序列，可在单管反应4小时内获得20-100μg，完全满足基因编辑的需要。

图3：不同时间的sgRNA的合成量

对于sgRNA Synthesis Kit不仅要满足产量上的要求，还需要针对不同种类的sgRNA合成也要达到相当高的产量，方能满足不同类型基因的编辑需要，扩大试剂盒的应用范围。翊圣sgRNA Synthesis Kit经过多个种类的sgRNA的合成，其产量也是很高，可以满足实验所需，因此可以适应多种基因的编辑需要。

图4：不同种类的sgRNA的合成量

在影响CRISPR/Cas9系统的编辑的效果成败的关键因素中，合成的sgRNA的品质也是关键一环。因为合成的sgRNA的纯度（即品质）不好，对编辑的效率会产生很大影响。翊圣sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA经过安捷伦2100测定，其条带明显、单一，纯度高，说明品质较高，对后续的编辑效率会有很大提升。

图5：合成的sgRNA的品质（安捷伦2100测定）

最后，所合成的高品质sgRNA是否有活性，需要实地测定才能发现其是否有活性，是否能够与Cas9 Nuclease进行组合达到编辑基因的目的。翊圣sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA与Cas9 Nuclease进行组合体外切割靶DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测发现所合成的sgRNA可以有效引导Cas9 Nuclease在特定位点切割并产生特定大小的DNA片段，因此具备活性。

图6：sgRNA的剪切效率效果图

翊圣生物提供您高品质、高性价比的sgRNA合成试剂盒，让您的CRISPR/Cas9科学研究及相关基因编辑应用如虎添翼，共同为人类的未来健康奉献一份力量。

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【1】王晗月,杨晓菲,胡巢凤,李富荣. CRISPR/Cas9基因编辑技术在糖尿病细胞治疗中的应用研究进展[J]. 生命科学,2019,07:723-73.

【2】Hryhorowicz M, Lipiński D, Zeyland J, S?omski R. CRISPR/Cas9 Immune System as a Tool for Genome Engineering. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2017;65(3):233-240. doi:10.1007/s00005-016-0427-5【3】Lone BA, Karna SKL, Ahmad F, Shahi N, Pokharel YR. CRISPR/Cas9 System: A Bacterial Tailor for Genomic Engineering. Genet Res Int. 2018;2018:3797214. Published 2018 Sep 18. doi:10.1155/2018/3797214

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