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简化甲基化测序 (RRMS) 可捕获 100% CpG 岛且不止于此

首页 » 产业 » 快讯 2022-09-28 转化医学网赞(2)

导读	该方法可靶向基因组中的重要区域，从而能以经济高效的方式，对感兴趣样本表征全基因组的甲基化模式。

该方法可靶向基因组中的重要区域，从而能以经济高效的方式，对感兴趣样本表征全基因组的甲基化模式。

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图 1 采用 AS 的 RRMS a）读长长度分布 b）Bed 工作流程 c）特征序列 d）测序序列对比定位序列 e）覆盖度 f）示例区域 g）与 RRBS 重叠 h）已识别的 CpG i）与 RRBS 的相关性

自适应采样可增加靶向序列的覆盖度，因此仅用一张 MinION™测序芯片就能识别基因组关键区域中8M的高置信度CpG，并且准确度高

纳米孔测序能够直接检测甲基化胞嘧啶（例如在 CpG 位点），而无需亚硫酸氢盐转化。CpG 位点常出现在称为 CpG 岛 (CGI) 的高密度簇中。>60% 的人类基因的启动子是嵌入在 CGI 区域的。启动子内甲基化模式的变化与基因表达的变化相关。简并代表性亚硫酸氢盐测序 (RRBS) 无需测序整个基因组，即可实现全基因组甲基化分析，但此方法成本高昂且耗时。此外，其文库制备方法复杂，精确度不高，不能靶向任何特定启动子区域。自适应采样 (AS) 是一种快速、灵活、精确的方法，可在测序过程中去除脱靶区域，从而富集感兴趣区域（例如 CGI）（图 1a），无需预先处理样本。此处，我们将 Oxford Nanopore的甲基化检测方法与 AS 相结合，并在两对肿瘤/正常细胞系中将该方法的性能与 RRBS 进行比较。我们使用图中所示工作流程（图 1b）制备 AS 靶向区域文件，覆盖 310 Mb 的基因组，包括约 28000 个CpG 岛和其他关键特征序列（图 1c）。AS 保留的数据比例高于 RRBS，且在靶区域的读长序列比例更高（图 1d 和 e）。AS 显示出比 RRBS 更均匀的覆盖度（图 1f），恢复了更多的 CpG（图 1g 和 1h），并且可重现性高（图 1i）。

图2 使用 RRMS 检测的肿瘤/正常细胞差异 a）工作流程 b）DMR c）CpG 岛 d）和 e）5mC 和 5hmC 的分布，f）示例区域 g）靶区域的读长序列 h）CNV i）拷贝数/染色体

可以探索不同样本之间的甲基化模式，以识别大量差异性甲基化的特征序列。丢弃的读长序列也可用于识别拷贝数变异 (CNV)

探索肿瘤和正常组织之间的甲基化差异有助于阐明与肿瘤形成和发育相关的机制。我们在一名男性患者的转移性黑色素瘤细胞系以及与之配对的正常组织 (COLO829/COLO829_BL) 和一对三阴性乳腺癌细胞系(HCC1395/HCC1935_BL) 中，通过 AS 采样比较了各区域的甲基化模式（图 2a）。我们能够检测到与肿瘤样本相关的数千个差异甲基化区域，其中很大一部分其全长 >90% 的序列与癌症基因普查数据库中的重叠（图 2b）。抑癌基因启动子和重叠的 CpG 岛通常高度甲基化，这导致了它们的基因沉默。可以看出，这些区域中的高甲基化丰度高于低甲基化（图 2c），所有 CpG 岛的平均甲基化分布也反映了这一点（图 2d）。虽然关于 5hmC 在癌症中作用的研究少于 5mC，但有了纳米孔技术，我们就可以识别这种碱基修饰。我们可以观察到，与正常组织相比，肿瘤中的 5hmC 甲基化频率较低，这符合预期（图 2e）。在图 2f) 中，我们展示了与差异甲基化区域 (DMR) 重叠的启动子。该 DMR 与从头测序的甲基转移酶 DNMT3A 重叠，且与配对的正常组织相比，两种肿瘤样本中该区域均有明显甲基化。这些甲基转移酶对于建立和维持正常的甲基化水平至关重要，所以它们的失调可导致癌症发生。因此，这种类型的分析有潜力成为一种监测肿瘤进展的方法。最后，我们展示了以下信息：AS 过程中被弹出的读长序列可用于识别整个基因组的拷贝数变异。因此，AS 方法提供了有关肿瘤表征和甲基化状态的关键信息。我们还发现，RRMS 与全基因组 ONT 测序和短读长全基因组测序均高度相关（图 2h 和 2i）。