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【干货】LAMP检测各种常见染料一览

首页 » 产业 » 快讯 2022-09-26 转化医学网赞(2)

导读	本文整理了近十年来常用的几种染料，供各位同仁开发LAMP检测试时参考选择。

在过去的十年中，等温扩增(如HCA、MDA和环介导等温扩增LAMP)在即时护理(POC)诊断中发挥了越来越重要的作用。

等温扩增具有与qPCR相似的灵敏度和特异性，但是在快速、低成本和便携性方面具有优势，因此成为在资源有限环境下可用来进行现场检测的理想选择。

LAMP检测染料

LAMP反应产物的检测方法包括：电泳法、浊度法和染料法，其中电泳法和浊度法是终点检测法，而染料法现在更为常用，可实现实时检测。

LAMP染料法中用的染料包括两种：

荧光染料：自发光荧光染料和嵌合型荧光染料

比色染料： （colorimetric dye）：pH指示剂

本文整理了近十年来常用的几种染料，供各位同仁开发LAMP检测试时参考选择。

荧光染料

1. 自发光荧光染料

常见的自发光荧光染料有：羟基萘酚蓝HNB和钙黄绿素Calcein。

羟基萘酚蓝(HNB)

一种金属离子指示剂, 变色原理为:HNB与镁离子结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色,随着反应的进行,Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀,羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色,而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色。

钙黄绿素（Calcein）

使用钙黄绿素的时候体系中必须要添加Mn2+，钙黄绿素作为螯合剂会跟Mn2+结合处于猝灭状态，不显示荧光，LAMP反应过程中产生焦磷酸会与Mn2+结合解除淬灭状态，钙黄绿素与Mg2+结合发出黄绿荧光。钙黄素的使用对反应体系当中的 Mg2+的浓度要求很高，所以体系中Mg2+需要优化。

2.嵌合型荧光染料

常见的嵌合型荧光染料有：Sybr Green，EvaGreen，Syto。这一类染料会渗入到DNA双链的小沟中，与双链DNA结合以后，荧光信号会增强 800~1000倍。

↓常见的荧光染料整理对比↓

2019年科研人员使用包括Sybr Green，EvaGreen和多种Syto在内多达23种荧光染料进行LAMP检测平行测试，研究显示，Syto82 和Syto9是相对灵敏度最高、对检测没有抑制作用的荧光染料之一（1）。Sybr Green随着反应中DNA扩增产物的不断生成，与双链DNA形成的嵌合物越来越多，会对Bst DNA 聚合酶链置换活性产生抑制作用，从而影响反应速度，所以不适宜在反应前加入。而如果在反应结束以后加入，打开管盖则极易导致气溶胶污染，从而造成假阳性。

当然，通过把荧光染料滴加在反应管的管盖上，反应结束以后，将染料弹入或离心与反应体系混匀，这种操作方式可以避免Sybr Green对反应效率的影响以及产生气溶胶污染。

荧光染料法可以通过将染料加入到反应中从而实现实时和视觉检测，适合用于要求高灵敏度的POC检测中。

比色染料

LAMP反应在合成DNA的过程中，释放的副产物包括焦磷酸根和氢离子，因此反应液的pH值会随着反应进行而产生变化，由初始碱性变为酸性，如此显著的pH值变化为探测LAMP反应产物提供了另一种可能，即通过使用pH敏感指示剂作为染料检测DNA扩增，实现肉眼对扩增结果可视化的判断，区分阳性和阴性结果。

使用pH指示剂为染料的反应要求反应液低缓冲度（低浓度Tris），pH值8.8以上。pH指示剂染料浓度在50-100uM/反应（2）。

使用pH指示剂作为染料的方法，让低成本、便携式的快速LAMP检测更容易实现和普及，但是，pH染料指示剂不使用所有等温扩增方法，例如解旋酶依赖性扩增(HAD）。

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2. 与其他同类商业试剂相比，具有最快的反应时间(TTR)和更少的NTC

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4. 可通过冻干或风干开发常温稳定的检测

5. 免除冷链运输和储存，常温保存期限更长

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更高灵敏度和特异性，更低NTC

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