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一文全面了解代谢流-新型的代谢组学技术

首页 » 研究 » 组学 2021-08-23 谱领生物赞(102)

导读	代谢流作为一项可以动态反应代谢流量变化的技术，已经在越来越多的高质量SCI论文中被使用。本文作者将带大家认识这门新型的代谢组学技术。

随着代谢组学技术不断发展、研究不断深入、应用不断丰富。从最初十来个样本的非靶向代谢组就可以发个不错的SCI论文，到后面非靶向与靶向结合，其对于代谢组学和应用案例本身要求也越来越高，而代谢流作为一项可以动态反应代谢流量变化的技术，已经在越来越多的高质量SCI论文中被使用。下面，作者将用十几分钟的时间带大家认识这门新型的代谢组学技术。

一、关于代谢流，你可能首先需要知道这些：

1. 什么是代谢流？

代谢流是利用稳定同位素示踪技术，追踪代谢物在整个代谢反应网络中随时间变化的动态过程，代谢流技术可以帮助我们更好地理解细胞内代谢网络的代谢物水平变化、流量分布和周转速率，发掘主要代谢异常通路及其生物学功能，并揭示其上下游相互调控机制。这可为疾病发生机制的理解、药物靶点的发现等提供强有力的科学依据。目前代谢流分析已经广泛应用于代谢相关疾病，如：糖尿病，癌症，免疫和神经退行性疾病等的发病机制研究中。

2. 代谢流的研究流程

(1) 动物模型的研究流程如下：

动物模型的流程一般先是基于感兴趣的生物学问题选择适当的稳定同位素示踪剂，然后施用于模型生物（例如输注、注射、管饲固体或液体饮食）。随后从模型生物中收集组织或血液样本，并进行处理。然后使用分析技术（如质谱）对于已经提取代谢物的待测样品进行检测，分析示踪剂中同位素标记物向下游代谢产物的掺入。得到的数据可以评估和解释不同代谢物的同位素富集概况，以了解不同细胞内代谢途径的活性。另外，这些富集图谱可以与细胞外（如血液）测量结果结合在一起，并集成到系统级代谢模型中，以显示实验对象的代谢状态的定量读数。

(2) 细胞模型研究流程如下：

首先，要设计最佳的示踪实验，以确保通量的足够分辨率。然后进行标记实验，同位素标记和外部速率测量，代谢模型的建立，最后进行通量计算和统计分析。

3. 代谢流的应用

目前，代谢流已广泛应用于生理学研究、基因与蛋白质功能研究、病理学研究（如肿瘤、肥胖和糖尿病代谢）、微生物工程等方面。代谢流分析可以定量化表征细胞代谢体内的动态变化和代谢途径的流量精细分布，揭示疾病发生发展过程中的主要代谢通路变化，促进对生理或病理机制的认识。还可以寻找细胞生长、增值等过程的信号传导通路中的关键基因，结合酶的反应动力学性质描述代谢网络特性。

4. 代谢流研究常见问题

(1) 示踪剂的选择：体内稳定同位素测定成功的关键在于示踪剂的选择。示踪剂的选择必须根据代谢途径来选择。放射性示踪剂（例如¹⁸F、³H、¹⁴C）和稳定的示踪剂（例如²H、¹³C、¹⁵N）均可用于研究同位素示踪剂体内代谢。

放射性示踪剂的特点：灵敏度高，特异性强，可用于测定单个预定义路径的活动。但是放射性示踪剂具有半衰期，而且具有放射性，需有资质的专业实验室才能进行。

稳定同位素示踪剂的特点：灵敏度低但通常标记深度高，但可以一次查询多个途径，从而最大程度地利用单个实验收集的信息量，延长和重复给药更可行。

¹³C全标葡萄糖是最流行的体内示踪剂，它能够迅速标记中心碳代谢中的许多途径并且成本相对较低。除了¹³C全标葡萄糖以外，在体内测定中越来越多地使用基于其他分子和同位素（例如¹⁵N、²H）的均一标记示踪剂，以全面测定涉及脂肪酸、酮体或氨基酸代谢等的途径。

(2) 递送方法的选择：迄今为止，已经成功地实施了多种用于体内稳定同位素示踪剂递送的方法，包括通过饮食或通过管饲法口服递送，或通过静脉内输注或腹膜内注射直接引入循环中。具体方法应由根据具体关注的生物学问题进行选择。无论选择哪种方法，都必须注意在示踪剂管理和进一步采样期间对实验条件的控制和标准化，以便能够从示踪剂实验中提取出可重复且生物学上合理的结论。

输注是体内测定中示踪剂给药的运用最广泛的方法。在规定的时间段内以恒定速率向血液中施用示踪剂，然后评估示踪剂进入下游组织代谢产物，可以最大程度地减少与养分管理高峰相关的剧烈瞬态效应。但是输注具有增加的侵袭性和技术复杂性以及成本高的缺点（成本高通常是因为需要大量的示踪剂），并且在研究饮食代谢产物时可能不是最佳的。

(3) 代谢通量分析（即MFA）：在标准的同位素固定MFA中，将细胞内代谢物的稳态标记模式与细胞外营养摄取或分泌和细胞生长的测量值结合起来，并整合到由于细胞内或细胞外代谢通量而引起的原子转移的数学模型中。然后，在吸收、分泌和生物量生长速率所施加的约束下，执行计算迭代过程以估算最适合所测标记模式的通量值。

在体内应用MFA会带来一些障碍，主要问题是体内吸收和分泌速率的确定，通过循环不同器官之间的代谢物交换使该过程变得复杂。此外，鉴于体内示踪剂实验的持续时间通常很短，根据同位素固定MFA的要求，组织内不一定总能达到稳态标记，而动态体内测量通常仅对血样可行，这限制了INST-MFA的适用性。

5. 当前代谢流研究遇到的问题及解决方法

遇到的问题主要包括：组织异质性，真核生物代谢的区室特征，以及未建立单细胞和单细胞器代谢组学方法。

解决方法主要的有：

(1) 在代谢猝灭和代谢物提取之前，使用荧光激活细胞分选术（即FACS）根据细胞类型特异性标记物对异种细胞群体进行预分选。

(2) 采用在全细胞中快速分离线粒体和溶酶体组分的方法来探测这些细胞器的代谢。或者基于线粒体的表位标记以通过磁免疫沉淀进一步分离。

(3) 质谱成像（即MSI）空间代谢组学也许是应用最广泛的技术，具有在亚细胞（甚至亚细胞器）分辨率下表征代谢物水平和同位素标记模式的能力。当前基于MSI的方法是还需要在空间分辨率，代谢物覆盖范围和灵敏度之间进行必要的权衡。但是，可以预期，MSI仪器的不断改进，以及更高效的电离方法和替代采样方法的发展，将很快使单细胞示踪剂分析和代谢组学在体内代谢研究中成为常规应用。

二、代谢流研究示例

1. 实验材料：

CRC（结直肠癌）组织样本

正常组织样本

2. 研究方法：

此研究通过质谱和基于13C的代谢通量分析，确定谷氨酰胺依赖的三羧酸（TCA）循环回补是 SIRT5 调控大肠癌细胞的主要代谢途径。还揭示了 SIRT5 对 GLUD1 脱戊酰化和功能激活的调节作用，表明 SIRT5 是大肠癌潜在的治疗靶点。

3. 研究结果：

SIRT5 下调导致 TCA 循环和谷氨酰胺代谢发生变化，包括谷氨酸丰度增加和 α- 酮戊二酸（α-KG）水平降低。几乎所有 TCA 循环中间产物的急剧减少。

谷氨酰胺被代谢为 α-KG，它提供碳的临界入口点，为 TCA 循环提供燃料，并支持癌症中的合成代谢过程。这些结果使我们推测 SIRT5 可能在调节肿瘤谷氨酰胺代谢中起作用，从而影响 TCA 循环代谢产物的丰度。

三、谱领生物代谢流服务方案：

如果您对于代谢流很感兴趣，也可以通过谱领生物获取进一步的相关知识或咨询服务。

谱领生物可提供国际一流的代谢流组学服务，主要基于稳定同位素标记实验（即同位素示踪），其原理是将同位素标记底物掺入代谢网络的中间体中，除了用于定量确定代谢网络中的流量结构外，还可用于代谢流量的定性评估，如：代谢途径对某些碳源的依赖性以及在节点将流量分布在不同的路径。代谢流组学是评估代谢反应速率的有力工具，为分析代谢流量提供一种解决方案，可让我们深入了解代谢网络的代谢流量，并有助于理解代谢的改变对病理的贡献。

1. 常用试剂：

基于¹³C、¹⁵N和²H 等稳定性同位素标记的代谢前体物：

[1,2-¹³C₂]-glucose、[U-¹³C₆]-glucose、[U-¹³C₅]-glutamine、[¹³C₅,¹⁵N₂]-glutamine 、[¹³C₄]-aspartic acid、[¹³C₃,¹⁵N]-serine、[¹³C₂,¹⁵N]-glycine 、[U-¹³C₆]-fructose、D₂O

2. 常见的样本：

各类细胞，组织，微生物菌体，培养基和发酵液。

3. 覆盖途径：

糖酵解途径、三羧酸循环途径、磷酸戊糖途径、氨基酸代谢(Glutamine, Serine, Tryptophan, Leucine, lsoleucine和Valine等)、脂肪酸代谢、一碳代谢（叶酸代谢、蛋氨酸循环）、核苷酸代谢、NADPH 等能量代谢途径

4. 仪器平台：

根据不同的实验要求，我们配套不同的质谱平台进行检测。