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实录 | 2019年第六届NGS创新开发者大会(二)

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导读
2019第六届NGS创新开发者大会于4.26在杭州宝格丽雅国际宴会中心盛大开幕

主题:2019第六届NGS创新开发者大会

时间:2019426日下午

地点:杭州·宝格丽雅国际宴会中心

提示:实录中所涉及图片详情请查看大会图片直播 https://live.photoplus.cn/activity/live/pc/2731989/#/


主持人:今天下午的会议开始马上,请大家给予一点点掌声!

大家好,今天下午正式开始了,得到还带着中午饭意的饱嗝和有一点轻松的目光看着我,我理解到了。

我们这个会议是同行的聚会,这个同行中间整个在NGS领域上下游整个生态圈的人都来了,当然这里有很多人认识我。我是刘静雅,后面有我简单的介绍。

我自己的背景是分子遗传,我以前工作在华大基因有一段履历,后面几个合伙人一起出来做了一支基金。这支基金很明显,也是跟生命健康相关的。所以我们自称我们自己是生命健康行业的,我们也不说我们是投资人,因为本身基金和产业也要走得更近一些,要不然基金也没什么前途。

很高兴今天站在这里跟大家主持会议,主要是受会议主席的邀请,当然我自己也有些私心,我也想曝光,请摄像头对着我。

这个会议是很轻松的环节,同时会议也是页行业里的人一起支撑起来,所以在这里我必须要口播我们的金主爸爸。隆重感谢我们的金主爸爸们:HGBC、贝壳时代、倍数资本、贝壳社、顾大夫工作室、华大智造,贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司、illumina China,明码生物科技、为度生物、翊圣生物、达仁基因、PerlainElmer、赛默飞、菁良基因科技、金唯智、厚泽生物、币冠生物、GeneBocH。感谢各位金主爸爸们!我们希望更多的行业里面的金主爸爸以及不是这个行业里的人能够加入这个行业,一起在这个里面做点事。谢谢!谢谢各位!

我们今天把现在主场交给我们在这个领域一直从事和深耕的企业家们、科学家们,有你们在,所以这个行业才会这么蓬勃生机。所以下面有请下午第一场演讲嘉宾,他是蓝晶微生物的张浩千博士,掌声有请!

张浩千:站在台上才知道原来人有这么多,非常感谢郝总的邀请!我自己其实是非常专业学科背景的,我是在北大学生物,后来又读的物理PAD,以前拿过化学奥赛的一等奖,所以各种各样的很交叉的背景。我公司叫蓝晶微生物,我从事的领域叫合成生物学,应该是NGS行业下游。

其实大家都能观察到一个非常有意思的现象,基因工程其实不是一个特别新的词汇了,大概从上世纪七八十年代从基因泰和(音)开始就有了基因工程的理念。传统基因工程,其实从基因操作深度来说,还是比较浅的,不管从胰岛素还是做黄金大米还是说大众化学品,其中在座各位今天中午午饭中至少有三分之一的,除了植物生产的产品,有三分之一的调味料、香味、味道其实都是用基因工程改造过的微生物生产的。所以说,即便如此,它在我们的日常生活中已经有如此的穿透力了,其实我们基因工程发掘深度还很浅,是个位数的基因。其实在天然生物资源中有大量的生物资源还没有被发掘,为什么没有被挖掘?有一个很简单的数据,现在大家都说虽然有超级细菌、抗元素都被用完了,但其实单就肠道微生物中,还有30万种新的化学结构还没有被发掘。为什么没有被发掘?因为99%的微生物都是不能被培养的,你测序能看到它,你大概通过生物细菌的方法能够知道它大概合成了哪些类的化学物质,但是它们通常都太大了,它们都是几十K到上百K,涉及到的往往是几十个基因。别说几十个基因,几十人干活还要组织半天,几十个基因是非常复杂的调控网络。怎么样把它用起来,真正为人所用,这是生物技术一直在最前沿所面临的问题。

解决方案是什么?应对复杂问题的解决方案,人类文明有非常好的解决方案:工程化。什么意思?我不再是拍脑袋设计,为什么莱特兄弟之前很多人做飞机没有做成?莱特兄弟做成飞机关键是什么,可以看到他做的飞机非常挫,你很难想象通过这么一个东西,能想象到现在的东西,但它们的实质却是一样的。实质一样在哪里?他们不是通过把自然鸟驯化出来或者单纯的模仿,而是把力学的数据和飞起来这件事情的原理结合起来,来合成一架飞机,他理性设计出一架飞机。工程设计其实在我们传统的工程领域有很多效率提升的证据,摩尔定律是最典型的,计算机每隔18个月就厉害1倍,它背后的本质是可持续提升的工程能力,其实已经跟我们发展很成熟的电子工程系统类似,生物系统也呈现出这种层级结构。

这种层级结构,使得我们可以把生物系统看作是它以基因,也就是以基金作为元件,自下而上组装起来的工程系统。我们NGS行业其实已经产生了海量的生物数据,目前全世界已经产生了NGS数据比五家优酷上面的视频总量还要大,怎么把数据应用起来,这是一个事,但也是一个巨大的机遇。天然微生物,我们通过基因测序和组学分析,就可以得到各种各样和生物海量的数据和设计原理。这些数据和设计原理,我们就可以利用它们,基于它们来对生物,比如说在我们这儿,这是我以前的研究中,针对微生物来做全新的微生物。比如说我想设计一个能够合成阿片类药物的微生物的话,我们大概从七八种不同的,反正从罂粟一直到老鼠还是到细菌,还是从人,各种各样的生物中,所有开源的生物基因都是我们去获取资源的对象。

实际上前几年在我们这个领域,其实已经可以做到整个细胞从转录、翻译、复制、蛋白质讲解各个过程都可以数据化,也就是说我们可以有数据卵生的活跃细胞,这个细胞所有的行为理论上都可以通过这个数据模型进行预测。

对于细胞进行改造,毫无疑问也是充满理性和有可预测性的。在我们合成生物学的行业里面,所有的企业,大家可以认为或者大家干的事就可以分成三个层次:自下而上来说,工具层是做各种材料供应、DNARNA的合成,还有功能元件库和基因编辑的工具服务和工具开发,再往上是提供软硬件的支持,因为合成生物学的操作通量非常大,比如说我的博士论文,当然是和几年前,我一篇论文大概要做五千个分子克隆,全是手做,非常痛苦,当然我们在这里面写了非常好的算法和软件做支持,这是好很多了。在应用层,因为基因工程改造出来的各种各样的生物应用场景、适配场景可能很多,所以应用层覆盖的垂直领域也非常各种各样。总的来说,越来越靠近应用层,市场越大。不同的层次,也分别诞生了既有新兴企业,也有传统产业,作为一个强烈的入局者的存在。目前我们行业在美国已经有两家纳斯达克上市企业,都是近几年上市的,还有两家独角兽。

我是从微生物作为切入点,原因生物最早就发源于微生物,而且它的技术积累比较充分,而且微生物跟人息息相关,它的测序技术、数据获取的能力比较成熟、数据比较充足。

在我眼里,我把微生物看作一种分子或者材料的新的制造方式,当然它是一种有平台运营的方式。生物比起传统化学有什么好处或者优势?我自己做了一个总结,生物特别适合做复杂的事情,有复杂官能团、多样杂原子、手持特异性。还有一个好处,它兼具了多样性和特异性,通过设计它在特种的通路,它可以合成特定的东西,但是一种分子可以有很多种衍生。另外在FDA和欧盟有一个市场准入门槛,就是说微生物以天然原料,通过合成和转化得到的产品,和植物、动物转化提取的产品,都是天然等同,都可以通过碳14进行鉴定。

在我工作的场景中,我们是从天然生物中获得非常多的基因元件,然后把基因元件抽入到适配特定场景的微生物菌种里面,当然这个过程中我们有数据分级、数据采集分析和操作研发自动化系统,在它的扶持下,基本上我们比起传统的研发,大概做一个产品出来要2年,我们基本上半年就能搞定。我们目前的工作流程大概是这样的,元件+底盘生成小规模原型,跟我们的合作伙伴合作,在合作伙伴的生产设施里面进行生产。最大的时候,我们做过35千升的使用场景。

我目前的数据库覆盖两千种高附加值生物小分子,这里列举了一些案例。左边PHAs其实是一种生物塑料,是医用包装和医用包装材料和日常消费者包装材料。下面的都是TA分子,基本上用作香料和重要的药物。右边是大麻,作为提取物,当然这是非成瘾成分。

我们在工作流程中,跟传统大家拍脑瓜或者是设计一个完全不一样的是什么?我们是自下而上完全理性的设计,我们有很多元件,通过实验表征得到数据之后,我们有自己的数据模型,适配到数据模型中,把生物上的功能抽象出来,抽象成相应的数据,在电脑算法的辅助下,针对目标功能进行基因元件的配置,最终得到你想要的功能。整个过程,大概半年之内完成。

目前我们做的事情很有意思,我们是逐渐在往医药场景上靠,眼前我们做了几个管线很有意思:1.PHA,刚才介绍过了;2.大麻,等会儿详细介绍;3.柠檬醛,其实是很多种维生素,大家知道21金维他天天吹自己,其实目前世界上能买到的所有的微生物,市面上你能买到的都是用化工和石油合成的,用生物特征特别贵,当然我们的实验室可以做到非常便宜;4.依克多因,这是一个护理产品;5.角鲨烷,所有的女嘉宾都知道,为什么?因为它是女性护理产品当中非常重要的一部分。

生物塑料PHA,是只能生物合成的天然聚酯类化物,是唯一一种在土壤和水里面,可以半年之内降解的材料。它比较大的机会是欧盟主要国家,其实咱们国家也在持续跟进,就是说欧盟主要国家德意法三国跟进,说要把包装材料中生物碳含量从30%提升到202560%,市场增量为7-14亿欧元。PHA在生物基、可降解性和拉伸性、硬度上比较完美的产品,它最大的问题就是贵。下面的照片,其实都是我们产品下游的合作伙伴做出来的照片样例。

我们怎么做?你的问题是贵,怎么解决?我们就在微生物下功夫。我们做出第一代微生物圆形里面,白色的是塑料PHA颗粒,第一代的时候含量很低。经过三四代,97%的细胞都已经是PHA,这是一个大胖子,它只是为生产PHA活着,这是在微生物层面。更聪明的是什么?在整个生产过程中最后一步的离心成本比例非常高的,怎么样降低成本?我们就在细胞里面设计基因控制线路,在细菌生长到晚期的时候,它会自发沉降。所以右边的照片,你会看到细胞生长的末期,它自己开始结团往下沉降。这种复杂的细胞行为,其实对我们来说,设计起来也不是那么困难,都很简单的。

我举的研发管线中第二个案例是大麻二酚。大麻二酚是大麻提取物的非成瘾成分。大家一定要注意是非成瘾成分,别到时候说这个成瘾要抓其实,目前在国内不在化学品,也不在违禁药品目录里面,只是说目前CFDA食药总局不监管它,生产和出口是完全没问题的,我们都问过公安部。它的机会在哪儿?2018年加拿大大麻合法化,但其实大家不知道的是:首先是全美工业大麻种植都合法,31个州CBD生产销售也合法,更重要的是FDA2018年批了以大麻提取物为核心的几类药,同又有二三十个相关药在临床二期到三期之间,所以这是一个即将爆发的很有意思的市场。这个东西的缺点是什么?也是爆贵,植物提取2000美元/公斤,食品提取5000美元/公斤,药品大概是10万美元/公斤。它还不能用化学合成,因为首先异构体会死人,以前出过这样的案例,所以这是微生物做合成的机会。

(图示)这是我给大家提到的一些企业的研发管线以及在批的药。

除了用生产物生产化学物本身只是一种应用场景,我们可以对生物进行功能化改造、深度设计的应用场景。除此之外有没有正在发生的趋势?眼前各位两年之后,你们手机的朋友圈到时候看到的新闻,可能是有的。这是美国大概5-10个在FDA做临床产品,他做的事情是什么?叫做活体药物。工程化的益生菌本身作为药物吃下去,去治疗疾病,比如说异形糖尿病,当然ABD大家也都在做,也不知道赚不赚钱。还有肝性脑病、高血压、PKUI型糖尿病,这几个是大家做临床的,好几个临床在研,预计最早应该是美国一家纳斯达克上市企业在今年下半年,应该会有三期数据出来,这是非常有意思的,它跟传统制药不一样的是什么?首先是分子不一样,我们也通过我们的关系咨询CFDACFDA对这种药友好很多,因为它是标准化的,这是第一。第二,它不仅是一种治疗方式,它还是一种药物递送方式,直接吃下去,在你患病的部位工作。更重要的是它还是可以排出题外的,而且整个工作环境在物理上也是除出体外,因为肠道在拓扑结构上其实是一个体外环境。所以这是大家在两三年之后,很快会看到的我们这个领域有穿透力的事情。

其实今天郝总邀请我来之前,我其实想了很久到底应该给大家讲哪些东西,因为我作为NGS行业垂直细分领域的企业,当然对我来说这是一个非常好的舞台去介绍我们自己做什么。我觉得更重要的是让大家去看一看,因为之前我有很到做NGS的朋友,像华大智造的朋友们,我很多至交都在那里,大家面临共同的问题是这个领域垂直有哪些比较大的机会,除了现在的NIPT之外接下来的机会在哪里?我觉得我给大家提供这方面的信息,一方面介绍我自己,另外一方面给他们拓展视野,提供信息,让大家看到新的机会。

整个行业赚钱的机会在哪里,或者投资创业的机会在哪里?从2018年一整年合成生物学创业企业融资总额是38亿美元,已经超过了基因测序的创投企业,是硅谷最热门的投资领域。它的CAGR44%,而且大家可能没注意到美国商务部和中国相关不敏都把合成生物学定义成颠覆性技术,双方进行技术保护和打击的时候第一条往往都是合成生物学,后面是神经科学等其他的。而且习总书记也多次对于合成生物学这个事,在两院大会,包括十三五规划中,都提了非常多。更重要的是深圳市和北京市尤其是以深圳市为代表,深圳市应该是把合成生物学这件事情是下一步重点进行政府引导、投资和扶持的垂直行业。我觉得这是一个非常好的机会,我也非常欢迎更多的朋友们更多进来。如果说国内企业就几家,确实没有什么意思,应该说大家都百花齐放,我们才会迸发更多的火花、产生更多的机会。

再次表示感谢,我也很期待能够与在座各位进行深入的交流。

主持人:谢谢张博士!请留步,我们给现场观众3个问题的机会,请大家踊跃发言。如果你们的问题非常好或者你们妙语连珠,我们的上头会剪辑到你,你有可能在抖音上刷到你的段子。

提问:谢谢张博士精彩的演讲!刚才您提到一个点,就是说现在有这种基因改造过的益生菌可以通过口服的方式去做一些诊疗,但是我们知道它如何有效,或者能够保留多大的活性,活着到我们的肠道,毕竟它经过一些消化道的酶的作用,所以这一块您怎么看,或者它跟粪菌,它的效力或者说作用是否已经超过粪菌,包括能否保持细菌原理落到肠道定址的部位?


张浩千:其实你这个问题可以拆分为三个子问题,第一是它怎么送进去,怎么活着到肠道,有什么解决方案,第二是否真正有效,最好是能举个例子,第三是说它是不是需要定值或者怎么定值。先回答第三个问题,从目前FDA正在批准临床实验的case来说都不是定值的,都是穿肠过,需要患者反复吃,我猜也是不允许它在肠道稳定定值。当然我不在企业里面,所以我也看不到最真实的原因,这是我的猜测。

第二个问题,它是否真正有效?我觉得可以给你两个案例:一个是好几个临床在研药物的治疗方式,发表过非常顶尖的科研论文,所以他们没有做了人,但做了动物论文,如果数据没有造假,这批论文可靠的话,这事是可以的。它的工作原理非常简单,举高血压的例子,肝性脑病最大的问题就是肝脏不行了之后,血压会很高。本质问题是怎么把氨消化掉,从血液里面排出去。他们就做一种微生物,微生物很聪明,因为微生物是贴着肠道的。肠道可以吸收东西出去,也可以排出来,它在肠道里面的微生物,帮助胺变成精氨酸,精氨酸是在肠道内外,而细菌通常缺精氨酸,精氨酸对细菌生长很关键。它做的非常聪明,至少在动物模型上看起来非常漂亮。

第二个案例,我看过一些企业的数据,基本上他们的数据都非常好,治疗这种复杂代谢病的话,效果都非常好。

回答第一个问题,怎么深入进去。方法有好几种,比如说做成胶囊吃进去,但具体的胶囊包裹技术我还不知道,但切实是用胶囊送进去。还有一些企业用乳酸菌,日常怎么进行繁殖我也不知道,大概有这么几种日常的解决方案。最早最快的反映是你今年明年会看到结果,大家拭目以待。因为这件事在国内其实还很早,美国是先锋性,美国会给你一个你想想不到的一个宽泛的专利,来激励这方面的创新。

主持人:我提一个问题。您的产品管线也好,或者是整体关于设计这些产品和产出的工艺制造流程,你们整体知识产权布局大概是怎样,你们是以配方型为主,还是发明,还是方法学?


张浩千:这个问题问得特别好,这里面本质上是可以把转化成那那样的问题,就是怎么做微生物本身重要,还是怎么用微生物重要。今天如果在工业制造,在我目前踏足的工业领域或者化学品领域,其实怎么利用微生物不是那么重要,为什么?我可以说一个数字,大家可以感受到:全世界七成生物制造或者发酵厂在中国,中国有七成在山东。如果这是一个特别高精尖或者知识产业密集型,山东省早不是现在,当然山东人民不要有这种压力,因为大家也都知道这是调侃。

所以问题在于微生物本身怎么被做出来,国内除了做药以外都在做附加值很低的东西,什么全年出口总额三千亿,我说还行,说出口总量两千七百多万吨,我说合着一吨一万多元,你是怎么赚钱的?为什么,就是因为大家的微生物都偷,以前都不知道怎么做出来,大家都相互偷,我这个企业本来就是从国外偷,大家相互偷,也没有知识产权保护,所以这块基本没有知识产权。在怎么做微生物方面,占整个行业专利的比例在1%都不到,在原来十年前。现在这些年,当然一方面是咱们国外国内企业往外走的时候遇到了问题,其实有好几家生物制造大型企业打官司之后直接活不下去了,因为在欧洲有很多官司打输了就活不下去。重视知识产权以后,其实现在整个行业里面最重要的门槛,还是怎么把微生物这件事情做起来。当然我当时调侃山东同志,是我跟山东同志关系非常好,我好几家合作伙伴都在山东,包括做的山东省专池专项扶持基金,我们都是受益者。所以包括怎么做微生物,包括NGS,每个行业都有自己的门槛,但是这个门槛本身可能是在快速变化着的。我目前给大家提供消息,就是怎么做微生物本身就是一个门槛。

主持人:今天上午经历了很多创新,尤其偏技术层面的比如说基因编辑、基因合成、甲基化,下面的所有环节都是围绕这些技术或者相关技术的应用,也有可能是临床的,也有可能是商业的。下一个演讲嘉宾,他在上午表现非常激进,希望待会儿也不要饶过他。有请亿康基因首席技术官任军上台!有请!

任军:大家下午好!我叫任军,在亿康基因负责技术研发工作。亿康基因是一家致力于把NGS技术应用于临床检测的研发企业。非常感谢今天大会的组织者给了我们这样一个机会,让我们能够和大家分享一下亿康近两年在辅助生殖相关检测方面的技术进展。亿康独立自主建立的这些技术与产品,都是非常具有很重要的现实意义,并且在世界范围内还没有其他人能够做到,至少还没有其他人能够做得像我们这样好的水平。因此,我们很有信心将这些技术和产品成为面向未来的技术与产品。

今天在座的各位中肯定有辅助生殖方面的专家,可我知道也有很多人对于辅助生殖这个领域并不非常了解,所以说我的讲述会多讲一些背景与技术概念,少讲一些技术细节。如果大家对技术细节有兴趣的话,可能下来和我一对一的沟通。

首先,我们来看一下世界在生殖方面面临着一些什么问题。现在我们面临着一个生育问题,生物总的存在和延续是生物的终极目的,而人类包括中国并不乐观。不孕不育已经成了普遍的社会问题,我敢打定各位的亲戚朋友会遇到这样的生育难题,想要一个孩子而得不到,面临了这样的问题会很痛苦。而这个生育困难的问题,在现在终极的技术解决方案基本是所谓辅助生殖技术。说白了,就是试管婴儿。而试管婴儿这件事不是那么乐观,平均的成功率只有不到40%,这用的是一个周期期,就是说做一次促排卵,得到了卵,然后去移植,这就是一个周期,不管你是否成功,而这个成功率是40%。如果母亲年龄大于40岁,只有26%的成功率,所以这是一个非常痛苦的数字。

为了提高试管婴儿的成功率,当然大家这么多年来一直在非常努力,我介绍一下所谓第三代试管婴儿就是这样的一个努力(图示)。试管婴儿是怎么做出来的呢?我们知道正常一位女性一个月只排一个卵,做试管婴儿的时候,我们要给她促排卵,一下子可能会获得N个卵,比如说10个。一般来说,从父亲那里获得精子是比较容易的,如果撒一把精子进去,这是所谓的第一代试管婴儿。第二代的试管婴儿是做单精注射,这个卵子固定了之后,这边把精子注射进去,这样可以解决少精问题,就是男性不孕的问题。再往下,如果你做了受精之后,可以得到受精卵,比如说10个,受精卵在体外培养,培养5天之后,它会形成一个囊胚,那么我们就得到了10个囊胚。到这时候我们必须做一个选择,不可能把10个全部植入子宫,只能植入一个,植入哪个?传统的方法怎么办?传统的方法就是用显微镜看,这个比较圆、比较亮,那就植入这个,这很显然不是很理性的方法,比较圆、比较亮的并不意味着它的染色体是正常的,如果是异常染色体的植进去,结局就是流产。所以说第三代试管婴儿就是在这一步加入了一个挑选的步骤,所谓的PGS/PGD,挑选至少染色体是正常的,生育潜能比较高的胚胎去植入,或者说挑选一个不携带致病基因的胚胎去植入。

(图示)这个图可以向大家展示第三代试管婴儿是怎么做的,当我们得到了受精卵以后,在体外培养,当培养到第3天的时候,大约这时候有8个细胞左右。培养到第5天会得到一个囊胚,这时候大约有100-200个细胞,下一步就是胚胎活检,再下一步就是要把很微量的只有三五个的细胞做扩增,然后做全基因组扩增,之后就可以进入建库、测序。在常规的做法,扩增与建库要分两个阶段进行,各要花N个小时,这是一个很长的过程。亿康的第一代PGD技术也是这样的,到第二代的时候,我们就可以把单细胞的全基因组扩增、建库整个过程合二为一,只需要三个小时就可以完成。那么,在现实中临床的意义是什么呢?我可以在9个小时里完成整个的检测,下午6点胚胎的活检样本送到检验所,早上8点前回馈结果,您这几个胚胎里哪个最好,应该去植入,这是现实的应用。还有一个现实应用的益处是,现有的扩增、建库是非常繁琐的工作,要换管就需要做标记,同时几十个标记,那么污染和出错的概率是很大。这个技术可以用一个管子,不需要换管,所以说对临床的推广是非常有意义的产品。

(图示)这是给大家展示一个例子,是检测的结果。非常的直观,我们把每一个染色体1-22号写在横坐标里。第一个胚胎很明确,所有的染色体就是2位体,然后一个X一个Y,这是一个男性。而1号染色体只有一个拷贝,这个胚胎不是一个好胚胎,植入进去必然流产。这个也是,这2号染色体的一半,成了3倍体,这个胚胎也活不了,还有更复杂的情况,我们不在这里讨论。

总结一下现有的PGD,当然二代的PGD也是一个有创的检测,必须依赖于胚胎活检,这是一个有创、有风险的操作。这时候是一个囊胚,是一个球壳,这是内细胞团,这部分是发展成我们人体的,而球壳是发展成胎盘的。所以说,从这个位置挖几个细胞走,至少现在的证据是安全的,但是这个技术比较短,现在没有人敢说,对活检安全性的怀疑是存在的。另外,活检本身就是一个风险性的操作,所以国家对这个技术的管制是非常严格的。在2017年,做所有试管婴儿的生殖中心有接近500家,但具有第三代试管婴儿资质的只有40家。因为什么?因为一个生殖中心成立以后五年之内,不要想向卫计委申请这个资质,你先把一般的胚胎操作练好,才可能去申请这个资质。

另外,在患者层面,你这是一个有风险的医疗操作,任何医疗操作在有风险的情况下就要平衡风险与获益比,必须获益高于风险,才能合伦理地把它应用于患者。既然有这个患者,那么适应症就受到非常严格的限制,比如说自然流产3次以上,反复植入失败3次以上的患者,才应该接受这个检测。这其中的痛苦,流产对女性造成的伤害,你先得承受了这些痛苦和伤害以后,才能合法去接受合并。很显然,一个无创的胚胎检测,是对辅助生殖领域可以有很好的帮助。

现在唯一能够做到的是亿康,在2016年的时候,我们第一次建立了一个技术,我们成功鉴定了第一个孩子。当然,这个工作到现在还没有其他家可以做,当然他们有这样的研究,不过成功率很低,80%左右,不能作为一个现实的普遍应用的技术,这还是做不到的。我们为什么无创呢?我们不去检测胚胎的活检物,而是检测培养液,这就是现实的照片(图示),受精卵在体外培养,是在液体培养机里的,这些无色的部分是油,加一滴培养滴,那么胚胎是在这一滴油里。所以在胚胎培养的过程中,会把DNA通过某种机制释放到培养机里去,这个培养机的DNA就构成了我们检测的物质基础。同时,当然它也存在着技术障碍,就是这些DNA首先是非常微量的,所以你得从培养机里直接扩增和检测。DNA释放到细胞以外后,会高度的碎片化,胚胎的培养机非常的脆弱,还可能存在母源细胞的污染,所以你要克服这一切的困难才能得到很好的检测。亿康正是克服了这些困难。所以说,它是一个技术系统,从前面的胚胎培养就要有所调整,到扩增、建库,这当然是它最核心的,还有数据分析,也要做相应的调整,所以我们有4项专利,这是一个技术系统,来保证能够做到无创的检测。

这两年我们和合作伙伴、临床医生来验证到底临床的有效性、获益性,这是刚刚完成发表的一篇文章(图示),在这里面大约有40多对夫妇,最终的妊娠成功率达到了58%,这是有创PGS大概能够做到的水平。一般的平均水平不到40%,增加了PGS检测以后,成功率提高到60%左右。因为怀孕成功确实是一个非常复杂的过程,除了DNA质量以外,还有其他的比如说母亲的因素、线粒体DNA的数量等等,所以说PGS一般能够使成功率从40%提高60%

关于地贫,刚才上午范博士也说,地贫在广东发病率可以达到10%以上,现在地贫有办法进行产前检测。但是即使你查出来以后要流产,对女性的伤害是无可避免的,何不选择一个好的胚胎植入进去。我们的技术一做出来,广东的医生非常的兴奋,就和我们一起来联合做这件事情。这只是一个可行性的研究(图示),这图里测了10NICS,这里面有8个胚胎,每个胚胎需要10NICS,至少每个都可以有几个可用的点能够帮助地贫的鉴定。这边是活检的做法,这边是图像机检测的做法,都有很高的一致性。

一个新技术出来,大家肯定会问与老技术相比准确性怎么样,这也是最新发出来的(图示),是美国哈佛大学Catherine Racowsky团队做的对比。这个研究设计是这样的,我刚才说了,传统的PGS是活检,活检100个细胞,做了10多个,还剩90多个,这是整胚。所以我们把这个整胚作为精标准,因为活检有缺活的问题,100个细胞里,可能有70个是正常的,30个是异常,你挖了3个出去,挖了哪3个呢?所以说样本并不能反映整体,整体才应该是真正的精标准。你培养它的同时,我搜集培养机做检测,挖掉三个细胞做检测,然后整胚用做精标准,这两边的检测结果和精标准去比,看阳性预示值和阴性预示值、准确度是怎么样的。这个样本不是很多,只有50多例,阴性预示值两者都能做的非常好,就是说我说这个胚是正常的,那它真正是正常的,这样就能够帮助胚胎移植成功,具有很好的作用。

在国外做单中心研究的时候,我们在国内也做着多中心的研究,就是以整胚为精标准去对比。(图示)上面PGS是有创的检测,NICS是无创的检测,大概是90%左右。胚胎植入前染色体诊断,这是平衡易位的诊断,后面我会说更多关于平衡易位的情况。从这个研究来看,也是能够达到很好的效果。

(图示)咱们最终的获益是要生出孩子,做起来实验就比较慢,要等孩子出生。这个研究设计是和PGS比做对照,这是和传统的显微镜看的方法比,这个研究还在进行当中,数据还没有出来。但是总体来看,NICS的效果和PGS相当,比形态学要好一些。

受于现在中国产品、技术上市监管的影响,所以现在我们NICS这项技术还在做临床验证的阶段,而在国外,在美国的环境下,反倒我们的商业推广可以更快一些。因此,现在我们在美国已经有两家美国的临床检验所正式采用了NICS技术,哥伦比亚有一家。我发PPT发给组织者到今天之间,加拿大又有一家接受。所以说,监管体制影响新技术能够有多快地使大众受益的很显著的影响因素。

再讲一下,除了这个以外,我们还有另外一些所谓更加面向未来的问题—我们的产品。在生殖领域有两个问题,其中一个是遗传性出生缺陷。在这里我给大家展示两个图,这个数据相对比较老,(图示)这是从2000-2011年出生缺陷变化的趋势图,上面是精神管缺陷,可以看到在这十年里脊柱裂的发生率在下降,它是什么原因导致的?是由于妊娠期叶酸的缺乏,所以说随着中国经济水平的提高,营养水平的改善,这个出生缺陷是在显著下降。再看这边什么在上升,这个曲线是先天性心脏病,尤其以绿线城市上升的厉害。先天性心脏病,以前长到6岁的时候就死掉了,没有办法把它的基因传递下去,而现在做一个手术他就可以长大,传宗接代,而它的基因就传下去了,这就是导致人在医学的支持下,我们的遗传基因会越来越差。当然,我用先天性心脏病做这个例子不是特别的恰当,因为先天性心脏病多数是多基因遗传导致的,对这类病还没有变化,单基因的我们有办法。

但是另外一种遗传性缺陷就是染色体病,就是所谓的平衡易位,这正是正在发生的情况。平衡易位是怎样的情况?像这样一个人,他的某两条染色体发生了交换,这个交换使这个人并不多一些也不少一些任何的遗传物质,所以这个人的表现是正常的。直到他的生育状态,他在产生卵子或者精子的时候,如果这两条正常的相碰到,那么这是正常的卵子和精子,如果这两个异常碰到的,那就是一个携带者,它也是平衡的,但是更多的配者是这个样子的,80%以上都是不平衡的。那么,这种配置形成的受精卵就必然活不了,所以说平衡易位的痛苦是生不出孩子,不断地流产。在现在传统的PGD技术,我们能够帮助他找到平衡的胚胎,但是无法区分这两者,所以说就导致他生出的孩子一半都是平衡易位携带者,这些人都会面临着他的痛苦。而且自然地说,平衡易位的患者流产以后就放弃了,他的异常基因就传不下去了,但是现在传统的PGD会使人群中平衡易位携带者的比例升高,人就会越来越麻烦。我们创建了从平衡胚胎里挑选真正正常胚胎的手段,平衡易位的患者最不缺的就是这些异常胚胎,我们以异常胚胎作为素材采集数据来推测正常胚胎到底是怎样的。

再往下就是刚才谈到的单基因遗传病,这里面无论是罕见病,还是非罕见病,我们都能够从胚胎挑选的角度,去避免植入这样的一个疾病胚胎。在这里面,这些年我们已经完全了150多种单子,每一个病可以是由不同的基因导致的,尤其比如说耳聋,它可以由几十个基因导致,所以我们做过的基因大约已经有几百种。

再往下就是整体的胚胎生育,想成功的妊娠,卵只是其中之一,母亲的条件也非常重要。所以说,你得在恰当的时机植入这颗卵才能成功受孕,而这个植入的窗口不同的人有不同的变化,导致有一些人很难成功。我们的做法就是可以用表达图分析的办法来鉴定这位母亲的受孕窗口,并且我们建立的技术是从宫腔液来做这个检测,这又是一个无创的检测,会对它的应用有很好的益处。

亿康从整个怀孕整个周期循环中来建立我们的解决方案,从对胚胎的无创检测去排除遗传病劣质的基因,到平衡易位状态的识别,到子宫容受性的检测,我们在提供整体的解决方案,希望能够对这个世界有更好的贡献!

谢谢!

主持人:谢谢张博士!张博士做的事是种子也要检测,土壤也要检测,连果实也要检测。现场请各位不要客气地提问,请踊跃提问。


我来提个问题,我从投资人角度来看,您把所有的解决方案从孕前包括植入前,连女性整个子宫都已经检测了,在对医院临床服务窗口的时候,因为你肯定不可能全程切入,肯定有一些点,比如说你实际操作做临床的时候,你基本上是把整个流程都介入了,而且整个流程还牵涉到不同的专家,您是怎么在实际操作中做这些事情,或者说困难难点在哪里?


任军:无论如何我们是一个辅助角色,生殖中心是真正的主角,生殖中心的水平也不一样,有一些中小中心自己并没有很强的技术,针对这些不同的客户需求,我们的解决方案也不一样。这是我们从第三方检测到IVD产品两条腿走路,可以把这样的技术输出出去,也可以把样本收进来,这是我们在两边都做的事情。

主持人:如果没有问题,我们掌声热烈欢送任博士!下面有请下一位嘉宾,iRepertoire Inc创始人王春林博士!

主持人:下面有请下一位嘉宾iRepretoire Inc的王春林博士。

王春林:大家好!首先我要感谢郝向稳同志邀请我过来,其实我参加过第一届会议,后来由于时间的原因一直没有,我今天讲的是《免疫组库技术在临床中的应用》。

其实人体每天面对各种各样的威胁很多,我们怎么处理?其实人体里面有一个非常奇妙的机制:VDJ重排,VDJ重排可以产生几乎是天文数字的多样性,也就是说每一个特定的重排,其实就是每一种抗体针对特定的威胁。它这个多样性的产生,是通过VDJ随机产生VDJBlame Blocks(音),再加上重排过程中引进很多随机的插入片段。我们知道随机插入有四种可能性,如果插了十个核苷酸,就要有410次方,所以数字非常大。

我们一般是用多重PCR的办法,来扩增重组的序列,最后通过二代测序的方法,来检测多样性。下面这张图,我们演示的是我们公司在美国的公司,用15千份样本,目前为止我们做了10万份样本,这是15千份样本的数据,线一直在上升,没有到平台,意味着我们能产生的特异性CDR数目很大。

其实我们的数据库里面,差不多有20亿条特异的CDR3

我们知道多样性很大,我们怎么用直观的图片表示多样性?左边的图显示一种表示方法:树型图谱。在这个图谱上,每一个特定色块代表特定的T细胞或者是B细胞,它的大小代表了这个细胞的丰度,我们把整个测序结果压在这张图里面,就可以看到左边这个图。我们下面有一个同事到时候会讲我们做的消费级产品。因为我们在国外开会,都会用这些图,所以我们用艺术性的处理,把人工智能引进去,我们用梦幻照片的风格,用人工智能影像,产生右边的图。

免疫组库有什么用?我们主要想通过免疫组库测序解释免疫组库和疾病之间的关系。第一个我要讲的是免疫组库在多样性评估的应用,下面两个讲的比较特定一点的免疫组库跟踪某些特定淋巴细胞的应用。

这是2015年左右发表的文章,是小鼠某个特定细胞B-1a细胞。B-1a细胞从2天一直到6个月,小鼠6个月相当于人的成年,上面那个点是很均匀,到下面那个点很大,这就演示出随着年龄的增长,免疫组库的变化。下面的点增大,表明多样性慢慢缺失,就是中医里面所谓的体质差,老年人的多样性和右下角的图很类似,也就是老年人很怕感冒。

所以我们做了免疫组库多样性、综合性的比较,比如说第一个是脐带血,这个样本几乎是小孩剩下来的时候,他没有任何经历,所以点与点之间的大小非常相似,而且分布很均匀,数量也很多。其实从我们做的结果来看,在正常情况下一个数量跟年龄有很大的关系,年龄人数量相对比较大,年纪大的人除了数量少之外,大的克隆数量也多。下面是一个成年人,还有一个感染的人,就是脸上有青春痘感染。还有一个自身免疫疾病,最后一个是白血病,蓝色的大色块就是我们所谓的白血病癌细胞,下面会讲到这个事情。

接下来我们就讲用免疫组库做什么,我们的做法是跟踪白血病里面的癌细胞。左边是用以往的技术跟踪白血病的方法,它是用MRD的。右边讲的是用定量PCR的方法,但用定量PCR之间实际上定量了癌细胞。左边主要是看癌细胞数量很多时候的流式细胞图谱,跟正常情况不一样,所以它就跟踪变化。现在用免疫组库的做法,相当于用二代测序的办法,看诊疗时候最大的克隆,我们认定它是癌细胞。在后续任何治疗过程中,我们就跟踪癌细胞或者VDJ重组的自然条形码。如果条形码还在,就说明癌细胞还在;如果条形码消失了,就说明癌细胞治好了。

因为这个方法相对于现在最好的技术,就是说除了二代之前的技术,就是定量PCR,它是十万分之一,而二代测序之前技术可以做到百万分之一,也就是说有一百万个细胞,我们可以看到某一个癌细胞在与不在。因为它做得更精准,所以对疾病的判定更精准,所以说可以根据精准的判定,来知道它什么时候应该终止治疗或者医生提前干预,可以显著提升患者的生存率。

免疫组库测序是测序列的,它还可以检测癌细胞上的高频突变。左图显示在整个淋巴细胞发育过程中,从干细胞到周边淋巴结的过程中,任何一个时间点,某个特定的细胞都有可能变成癌化。但如果癌变的过程离干细胞越近,干细胞不容易被杀死,所以治疗的效果不是很好。但如果它在外周淋巴结变成癌变,这个细胞很容易被杀死,也就是说治疗的效果非常好。怎么知道癌细胞是处于哪个状态?用免疫组库就可以做到,因为这次考虑到在B细胞发育过程中留下一些细节。比如说这个图上显示的细节,如果更像干细胞的时候,它没有什么突变,但如果是在末端,它会有很多负极,特别是高频突变。通过高频突变,我们可以判断癌细胞发生的时候是离干细胞近还是还干细胞远,医生可以根据这个信息调整他的治疗方法。这在过程,在二代持续之前,它是单独检测的,在美国单单检测这个项目要出五千美元。

下面是我们跟国内307医院做了一件事情,就是移植后细胞杂合程度的分析。我们知道造血干细胞移植的时候,因为有供体和受体,所以我们要考虑移植后在患者体内供体和受体的生存状况。这是跟307艾辉胜医生合作的,这个人相对比较牛。因为中医原因,我们接受西医比较晚,所以西医上真正有发明的不多,艾医生真正发明了治疗一种技术的方法:微移植,这是HLA半相合。所谓的半相合,就是我们在骨髓移植的时候,一般要检测10个基因,10基因完全匹配叫全相合,他只需要半相合就是一半就可以了,但要求供体和受体要有血缘关系,而且他不进行清髓,常规的骨髓移植是要把患者里面的骨髓用X光打掉,他不需要。第三个是只需要用少量的干细胞移植,并且供体的数量可以减小,我们这个例子里面用了三个供体,给到一个受体。

图的右手边讲患者在治疗前的免疫组库的状况,跟颜色没有任何关联。前面有三个供体的免疫组库,下面是患者接受了三种干细胞移植之后的6天、2.5个月、7个月之后的状况。红色代表的是供体1,深灰色代表的是患者自身,绿色代表供体2,蓝色表示供体3,淡灰色表示我们没办法判断它来自于哪一个。根据这个图,可以看出在6天的时候,大部分的还是供体比较多,占13.3%,到2.5个月之后供体达到53%,到了7个月之后44%。但是灰色的,根据整个趋势,我们推测青灰色也来自于供体。其实这个患者活了好几年,我三天前见到艾教授的时候,他说患者在进行追踪检测,看最终是哪一个供体的干细胞生存下来。

下面再讲一下我们用免疫组库搜寻疾病特异性TCR。抗原特异性TCR丰度非常大,最大值是病毒抗原很大。免疫细胞通过负筛选的办法,剩下的免疫细胞针对自身抗原的丰度都很低,最终最高的是自身免疫疾病,所以这也可以理解。所以说我们想找到某一种疾病特异性的抗原TCRT细胞),难度非常大,我们做了很多年,我有一个国际项目做了五六年,效果并不是特别好。这里讲的是一个实验室的方法,我们讲的是TB方法,主要是病人的血液通过体外抗原刺激的方法,联合负极,活化T细胞,以及干细胞的的分析,通过软件分析来解释,这是T细胞通过用TB抗原刺激,可以明显看到有活化性的细胞负极。通过检测,我们开始认为这个想法比较单纯,就觉得如果是同样的抗原,刺激完了以后产生东西是一样的,其实不一样。我们看到两个大的红点,刺激以后是扩征好的东西,但是相似度完全不一样。我们通过研究现象,发现与抗原真正接触的部分并不是一个整个CDR,只是很小的片段。从这个图上可以看出来,CDR中只有一小部分跟抗原直接接触。我们后来通过计算机的方法,负极小片段跟疾病有关的或者说抗原特异性的小片段通过电脑分析的方法。

负极完了之后,我们就可以搜索Bluk sequencing搜索富集信号。也就是说我们通过干细胞测序的办法,把疾病成因的信号源找到之后,你可以拿这个信号源反过来做诊疗,这是深圳做的Bluk sequencing,跟我们做单细胞测序是两个不一样的实验室,人群也不一样,但是我们可以感觉到非常好的信号,它的。

所以我要总结一下这个想法的人很多,但真正能做到这一步还是很难,因为它涉及到很多细节问题,特别是要通过体外刺激,通过比较强大的数据方法,来得到跟疾病相关的TCR

我刚才讲了好几个项目,所以说合作者比较多,有深圳大学的陈心春教授,有斯坦福大学的Mark Davis教授、黄璜教授。有什么问题?

提问:你好,谢谢精彩的报告!你中间提到你们用算法的方法去找疾病抗原特性的TCR,我不知道你们搜索的结果有没有用类似多线体染色的方法去切中,这是第一个问题。第二个问题,你们用单细胞的TCR测序地不能用来做诊断,我没太听清楚。


王春林:第一,成本很贵,单细胞在美国的成本是50美元一个细胞,所以说成本很贵。你刚才说的第一个问题,我们是有实验验证的。


提问:因为现在有一些尝试用vick(音)法做T细胞和干细胞的测序。如果这个能解决的话,您认为在诊断上跟Bluk sequencing测序意义是一样的?


王春林:干细胞测序在临床上应用基本不太现实。

主持人:这是一个很好的机会,尤其是免疫组尤其是临床免疫组非常火热。以后我们介绍的时候,简单介绍一下自己或者带一下自己的公司名。

提问:老师你好,我想问一下你的免疫测序现在用的是这种简单的多重PCR还是eras(音)的方法,目前成本应该比较贵,目前市场上应用多不多。

王春林:Bluk sequencing测序不是很贵,但是干细胞测序还是很贵。

提问:目前还是停留在科研方面吗?

王春林:最后一个介绍的,还是在科研上面。

提问:目前离临床应用还有点远?

王春林:最后一个还有远,还有很长的时间找到blame mark(音)。

提问:您提到的在mard领域?

王春林:这是最简单的做的事情,这个已经成熟。

提问:未来的应用潜力还是蛮大的?

王春林:我们在国内,也跟他们合作做类似的事情。

提问:你好,一个基础的问题。我看血液肿瘤TCR的复杂度很低,是不是在其他肿瘤也有这个现象?我理解一下来,是不是TCR复杂度低了之后,是不是意味着自体肿瘤免疫环境没有什么作用,肿瘤对自身的免疫系统有比较大的破坏作用导致这种现象?第二个问题,TCR在人群当中是不是有一定偏好?因为从理论上讲,如果是绝对随机的话,可能是1018次方种,但实际上是1014方种,所以在人群当中或者不同情况下,CDR所谓的种类还是有一些偏好,或者说频率有一定的特异性?


王春林:第一个问题,血液肿瘤是特殊的,因为血液肿瘤是特殊的,因为血液肿瘤是某一个淋巴细胞上的癌化,所以占比可以达到99%。正常的肿瘤,我没有看到这么严重的现象。但是任何疾病和健康人群来比,疾病人的多样性是比较低的,这是第一个问题。第二个问题,我们看过的数据,没有看到明显的偏差,就是说我们有看过21个数据,包括中国人,包括西方白人,包括黑人,甚至于混血儿,没有明显的偏差,它的随机性还是比较强的。

主持人:谢谢王春林博士!我们接下来是茶歇时间,10分钟的茶歇。接下来还有其他的讲座和分享,请大家移步茶歇,逛一下摊位。

主持人:下半场继续!我刚才碰到一个同行朋友,他直接过来和我说,我来参会了,拿了好几本册子,直接和我说我现在就来逛逛买买,我的生意在哪哪开张了,某某某个医院又开新单了,我现在又缺仪器了,产量又上不去了等等,听了以后非常高兴,他和我告别的时候和我说又去买买买了,我觉得太好。

下面有请下一位演讲嘉宾,是艾瑞普生物的CEO李松博士,大家掌声欢迎!

李松:大家好!非常高兴能得到郝总的邀请来参加这次NGS工作者的盛会。我要介绍的是我们艾瑞普公司即将在国内推广的一个免疫组库筛查的项目,主要是用来构建免疫健康大数据的一种有效手段。

我本人在icubateIrepertoire都工作过,和王春林博士是同事,他刚刚给大家介绍了免疫组库,这样的话,前言就可以简单介绍。

免疫组库测序是以T/B淋巴细胞为研究目标,扩增决定B细胞受体或T细胞受体多样性的多样互补决定区,再用高通量测序的技术来深入研究免疫系统的多样性和免疫组库与健康和疾病的关系。

以肿瘤免疫治疗、免疫重建和生物标志物的寻找为代表,免疫组库目前的应用几乎涵盖了所有疾病的预防、诊断、治疗和愈后的各个方面。这些年来,关于免疫组库的技术,无论是文章还是专利,都越来越多。尤其是随着免疫治疗火热起来,免疫组库检测技术也跟着火热起来。随着免疫组库测序技术的应用,对大规模人群进行免疫组库筛查,这个需求也渐渐迫切起来。

对免疫组库进行筛查,首先要解决的是一些关键的技术问题。第一个问题,样本的选择。是用gDNA还是mRNA?如何来取样、如何保险?样本如何保存,然后如何来提取。尤其当我们处理大量样本的时候,这都是比较关键的问题。第二个问题,扩增方法,信号保真的问题,我们如何通过高通量测序,把免疫信号真实的检测出来,这其中的关键是建库过程中如何不产生扩增的偏差以及对测序的结果进行纠错。第三个问题,大家都比较讨厌的一个问题,就是可操作性问题。大量样本的检测,我们如何对这么多样本进行管理、建库、测序。根据以上三方面要解决的关键问题,我们都提出了自己的解决方案。

首先,样本选择。免疫组库建库一般采用gDNAmRNA都有,它们也有各自的优缺点,当然从检测的灵敏度、特异性以及是否更加接近真实的细胞受体、蛋白表达方面来看,mRNA具有更多的优势。但是mRNA本身很脆弱的特点限制了它的应用,尤其是检测的时候,我们要求抽取外周血2个小时之内就要对样本进行处理,如果不处理的话会造成失真,这样对很多的应用就会产生一些错误的信号,甚至导致错误的结果。

受到上世纪在非洲检测艾滋病的启发,我们采用DBSDry Blood Spot)的方法来保存样本。它和常规抽取外周血的方法相比有很多的优势:第一,不需要专业的医护人员去抽外周血,任何人都可以随时随地采自己的指尖血到纸片上就可以了。第二,样本的运送、保存也不需要冷冻,拿一个信封就可以寄过去。第三,滤纸片样本的提取也非常的安全、简单、快速。结合我们后面要介绍的自动化建库系统,整个DBS免疫组库构建是非常安全和简单的。

滤纸片的样本能不能用来作为免疫组库建库的材料,最关键的问题是在于我们通过滤纸片采到的样本,能不能在某种程度上真实地反映免疫组库的信息。那么,我们就做了一个比较,在同样的样本同一个时间抽外周血和纸片血,构建了免疫组库。我们看到刚刚王博士已经介绍了,这是我们用的克隆表达图,每个色块代表一种信息,面积就是它的表达量。我们看到,纸片血和全血呈现的特征是高度一致的,相关性指数也在0.98以上,所以这个结果是非常一致的。唯一的区别在于分辨率的高低,就是用全血的时候可以看到很低的表达频率的克隆,但是纸片血毕竟取血量受限制,看到的是相对表达频率较高的信号。但是他们的多样性是可以进行比较的,也是比较相似的。更重要的是对于高频CDR3的检测结果,我们也看到,在全血中排名前50的,在纸片血中全部都检测到,排名前100名的高频克隆也只错过了3个。也就是说,从一定程度上,纸片血是可以反映免疫组库系统的一些真实信息的。

我们用样品的用量优化,我们发现用两片12毫米的纸片就可以成功建库。我们还比较了保存的温度,冷冻和室温没有区别,放1天、14天、1个月,我们现在已经做到放6个月都没有明显的区别。

解决了样本的问题,下面就是扩增的问题。刚才有个朋友问,你们是用多重PCR还是5Race?现在的免疫组库扩增基本上就是这两个方案,多重PCR5Race各有优点,当然也各有缺点,但共同的一个缺点就是不同程度地存在一个偏好性的问题。多重PCR的偏好来自于无法避免引物的偏好性,有的引物扩增效果高,有的引物扩增效果低。而5Race在于无法避免长度以及二级结构带来的偏好性,使得效率也会产生不同。这些我们都通过数据进行验证过。所以,解决偏好性的问题才能够拿到我们真正想要的信号。

为此,我们提出了Dam-PCR,它要解决的问题是在传统或者常规的多重PCR扩增里的几个问题:第一个问题,引物二聚体以及非特异性产物对扩增、测序资源的大量占用。第二个问题,多重PCR以及5Race建库中存在的偏好问题。第三个问题,可定量和纠错的问题。这个技术之所以能够解决以上的问题,我大概讲一下它的特点:第一个特点,在引物二聚体,非特异性产物生成前,通过物理方法去除引物。第二个特点,检测信号都使用通用引物放大。第三个特点,引入UMI系统实现分子定量。

(图示)这是一个扩增的结果,是我们第一代产品的多重PCR扩增,我们可以看到虽然有很强的特异性挑战,但是还是隐隐约约有一个非特异性。第二,我们在引物设计的时候,发现有一对引物,只要有一两个碱基的互补,就可以产生很强烈的dimer(音译),于是我们把这一对引物放到我们的扩增体系里,果不其然,我们做了强化,但是它还是有很强的dimer。后面两个是我们用Dam-PCR扩增,我们发现只有有效,非特异性的特征已经消失而那一对困扰着我们很久的能产生很强dimer的引物,并不能产生很强的干扰。因为Dam-PCR会把所有的扩增资源全部集中于对有效信号的扩增,所以扩增的重复性非常好,我想这样的图在别的可能做免疫组库扩增的PPT很少有愿意放的。

定量性又是它的另外一个特点,它的定量能力非常强。我们做了两个样本的互掺实验,就是两个独立的RNA样本按一定比例进行互掺,将互掺的样本进行测序。我们把两个样本单独测序,把测序结果按照互掺的比例做了一个计算值,将实际测序结果和计算值相比,我们发现它们都是非常一致的,这说明Dam-PCR有很强的定量能力。

当然,有了UMI,我们也可以对表达量以及测序过程中产生的偏差进行纠错。有了Dam-PCR的方法,我们还可以同时检测免疫细胞全部的7条链,也可以同时观察到治疗前、中、后高频的变化情况。

解决了扩增问题,解决了取样问题,剩下的一个问题就是建库的问题。虽然Dam-PCR有很多优点,但是它也有一个很大的缺点,它的操作是比较复杂的,因为我们需要物理去除引物等等,所以和很多建库方法一样,如果经过手动操作的话,费时费力,对场地、人员的要求都很高,结果还容易污染。即使我们也有自动化工作站,但是你如果不对整个的工作条件进行严格控制的话,也很难避免产生污染。为此,我们研发了一种全自动分子诊断系统,那个系统已经拿到了FDA认证,我们以这个处理仪为基础,发展了全自动的文库构建系统,这个系统其实是4个独立的操作单元,每个操作单元可以控制一个全封闭的卡盒,里面预装了所有试剂,通过卡盒就可以实现文库的自动构建。

接下来有一个视频,请大家观看(VCR)。这就是一个检测卡盒,里面预装了所有的试剂,你只要把样本加到卡盒里,然后把盖子盖上,再加到处理仪里,包括某些样本的提取、扩增、纯化全自动完成。完成以后,你只要把里面建好的库吸出来,定量一下就可以直接测序了。我们这个卡盒的灵活性很高,可以针对不同的测序平台开发出单独的应用。

我们通过纸片血样品、Dam-PCR扩增和自动化解决了免疫组库测序在大规模人群筛查应用中的技术瓶颈。

我们要做的项目是要用irepertoireiCubate独家授权在全球建立第一家以分子免疫为主要服务项目的一个服务中心。

因为PPT问题,我就给大家介绍一下。

我们要做的项目其实就是说如何来定义健康,因为现在我们对健康的定义很多情况下是用排他法的,你没有这个病,你没有那个病,把所有的疾病检测做了一遍,你没有病就是健康的,但是这是一个正确的定义健康的方法吗?就像托尔斯泰以前说过,说所有的幸福都是相似的,所有的不幸各有各的不幸,我们也这么认为,所有的健康都是有共性的,而所有的不健康是各有各的疾病。因此,我们是要通过免疫组库的方法来构建一个客观描述健康的指数。

像前面我们介绍了,我们可以检测免疫组库的多样性,检测Dimer clone(音译),我们是全世界最早开展免疫组库检测的,我们积累了超过8万个样本,现在已经接近10万个样本,超过20亿对UMI CDR3。在这些基础上我们发展了三个指数:

第一个指数,UMI CDR3数量(音译)。打个比方,一个国家的国防力量,UMI CDR3就相当于一个国家国防力量的总兵力。

第二个指数,多样性指数(Diversity index)。它其实是我们体内已经随时随地准备好的头50名,这主要是用来定义现在的免疫系统里有多少是可以随时随地投入战场的进行战斗的兵力。

第三个指标,基本指数。我们对20亿个UMI CDR3的发现过程中,发现只有非常少的一部分,这个比例大概在万分之一以下的UMI CDR3,是在个体中高度共享的。而80%以上的UMI CDR3是每个人各有的,而我们用这个来定义了一个基本指数,它是调查你体内有多少个高度共享的CDR3,它是我们体内就像战争的后备军一样,是一个国家国防的动员能量。

因此,我们基本上是利用纸片血来检测这三个指数,然后来定义健康的不同状态。

举个例子,比如说UMI CDR3数量很高,可是多样性指数没有那么高,这说明他的总兵力很强,可是用于作战的兵力没有,后备军也比较强。这比较像新生儿,因为他没有战争,刚刚生下来没有经历过各种疾病。另外一种情况就是多样性指数很高,UMI CDR3数量也很高,基本指数也很高,这就相当于是一个健康的状态。我既有很强的兵力,又有很强的作战能力,而我的战争潜力又很大,这就说明比较健康。如果是UMI CDR3的量很低,你的基本指数也很低,只有一些随时作战的兵力非常强,说明这个人已经和疾病战斗到最后一刻了,也没有什么战争的动员能力,只有在前线的几个兵。所以基本上我们是用以上三个指数来定义健康。

我们现在要启动的项目是(英文),国内是成立两家公司:联创生物技术公司(音译)、艾瑞普生物技术公司,来开展这个项目。

以上是我的分享,谢谢!

主持人:谢谢李松博士的分享!


提问:谢谢你的介绍。刚刚你提到了用UMI CDR3和多样性指数等三个指数来分析,这是非常有意思的概念。我有两个问题:第一个是技术层面的,如果用你们扩增的方法,测序的时候有没有能够完全地反映抽样的T细胞里所有的信息,会不会扩增的过程中丢掉一些?


李松:我们做了很多实验,比如说我们提一毫升或者更多的血,我们当时就做过很多实验,用不一样的input,每个检测都有其自身的灵敏度,我们发现我们检测的灵敏度,比如说在超过10个纳克以上的RNA是基本上没有明显区别的。当然,你说的非常低分度的,这是存在一定随机性的,这个无法否认,但是在一定频率范围以上都可以重复再现的。


提问:第二个问题,关于怎么理解多样性指标的问题。因为我是做肿瘤免疫的,我们会用类似排出法的方法去检查外周血里的T细胞,发现这个频率是非常低的。这些非常低频率的T细胞,并不能代表它没有功能,如果我们用抗原去刺激它的时候,这些细胞还是能克隆活化的。如果说在这样的情况下,我们在抽样的时候,就会极大程度上抽到这些扩增后的病毒抗原的特异性的T细胞,这不代表其他的T细胞多样性降低了,只不过我们抽样的T细胞有限,我们看到的比较少。那么你觉得多样性指标是不是能够准确地反映我们的健康状况?


李松:我们的免疫系统时时刻刻都在不停变化,和基因组是不一样的。多样性指标更多情况下表现的形式是我们体内正在被激活,正在作战或者说随时准备作战的T细胞的克隆表达情况。你说的这个情况,当然它在对抗疾病的时候,比如说T细胞是有活性的,但是当出现一个新的抗原的时候,当整体免疫系统下降的时候,当总兵力减少的时候,后备力减少的时候,仅有这个可以对抗,当出现了新的疾病进展的时候,就没有足够的兵力来对抗。所以这其实是一个全面观察的过程,不是说你只盯着一两个克隆来看,这也就是为什么我们要用三个指数来对整个免疫系统进行描述。因为我们最近也做了一些检测,做了一些肾癌的检测,通过对7条链的观测,发现这个diversity并不是某一条链上的,而是整体T细胞的diversity。它高的话,对一些治疗的效果就会好,有一些低的,整体的diversity不单是一条链,整个diversity低的话,可能会在治疗的时候会起到反效果。

提问:王博士讲到针对白血病在做免疫组库前后变化的筛选,而且刚才也提到接下来如果想要对其他疾病做深入研究的话,需要筛选更多的标记物。我不知道咱们是不是在做这样一个大的数据库的建设,是不是对不同的疾病模型去筛选。


李松:我这个PPT主要介绍的是我们主要要开展的项目,其实更准确地说是要做一个健康描述的项目。这是我们马上要推出的一个免疫组库检测的盒子,当然是通过纸片血的形式,我们的APP已经在谷歌和苹果商店里上线了,当然现在只是在美国的苹果商店,国内目前还没有。有兴趣你们可以下载。我们的想法首先是对健康或者是说每个人都可以买这个盒子,进行对自己的检测,当然构建了自己的免疫组库银行以后,我们同时也在展开一些疾病的研究,因为我们和一些研究机构都有在做各种各样疾病的研究,当你有了自己的基础数据,今后有发现新的信息都可以回溯到自己的数据库里进行比对。现在主要还是做健康方面,但是健康的数据库未来可以用来做对于疾病的预测或者诊断。


提问:我理解就是你们现在在建立一个健康人的免疫评价指标?


李松:对。

提问:谢谢!

提问:谢谢李博士!我有两个问题:第一个问题,纸片血我们都做过,只能是特别少的量,这么少的量,您也有数据展示,在数据的丰度上其实是不够的。那么,这个问题在健康人群里或许不那么严重,但是毕竟你给了别人一个结果,如果这个结果不完整的话,这是值得商榷的。


第二个问题,在方法学上,前面你也说了一个数据,我们做了这么多年的免疫组库测序,发现如果没有标准品放在里面,任何一个PCR是没有办法评估的,因为你不知道真实情况是怎么样的,我不知道你有没有加标准品,如果加了是多少,数据是怎样的?


李松:第一个问题,关于纸片血,我的PPT里讲了,我们一是检测dimer,二是检测几条链之间的表达量对比关系。当然,一张纸片差不多是搜集50微升的指尖血,我们一般也就是100微升的指尖血。(英文)的话,我们基本上可以产生2-6万个UMI CDR3,而指尖血基本上是3000-7000UMI CDR3,所以特别低频的话,确实通过纸片血是看不到。但是免疫组库起作用的并不仅仅是比较小的,很多情况下真正起作用的是dimer(音译),我中间有一个PPT里有对我们对三个治疗的前中后,可以看到真正变化的都在dimer上。至于对微小克隆的检测,当然还是用外周血会更全面一些,这个主要还是对体内的免疫状况评估的手段。有几个目的,一是用纸片血可以真正实现大量样品的检测,当然成本也比外周血降很多,所以更亲民一些。

第二个问题,标准品。我们在Dam-PCR扩增的时候,第一我们有互掺的实验,第二我们扩增的所有的靶分子,都进行过验证,所以定量性都是很好的。

主持人:相信都已经解答了大家的疑问,谢谢李模式!我们今天下午在基因应用这块讲了很多,比如说优生优育、人类健康机械的建立,接下来来讲一讲肿瘤方面,有请思勤医疗的COO张锋博士来分享他的主题演讲。

张锋:大家好!首先感谢会议组织方尤其是向稳总的邀请。我想跟大家分享一下《透视冰山:多变量算法智能判断用于泛癌种早期筛查》 。

中国癌症的整治现状。中国癌症发病人数居世界第一,每年新发病例440万人,每年死亡人数大概280万人。我们看另外一组数据,新发病例占全球癌症发病率大概25%,但是死亡率占了30%

我们看一下中美五年生存率的差异。官方数字,中国的五年生存率大概是39%左右,而在美国五年生存率可以达到68%,什么造就这么大的差异,接近快2倍的差异。其实归根结底最主要的是中国大概60%的癌症患者别发现和诊断的时候是中晚期,而在美国有生活经历的人都知道,不管是政府还是商业的保险,所有做筛查类的,比如说每年的筛查包括洗牙这一类预防列的项目基本上都是免费的,但是治疗的项目中间就要打折扣。而员工,要么就是员工自费,或者是公司付,医保里面不含它。所以我们的关注度不太一样,美国更加关注于早期的筛查。

我们看一下传统与创新的筛查手段。大家都很清楚这些内容,可能在座几位还都是医生,看一下血清蛋白标志物,大家都常听到,还有一些内窥镜检查,还有影像学CTMRIB超等,在各种癌肿还有细胞学的检查。但是对癌症的筛查来说,趋势一定是无创、早期的筛查,最好是针对所有的恶性肿瘤,再加上要作为筛查项目,性价比一定要高。我们看旁边的三角形,趋势是从局部,比如说关注于个别脏器的局部到泛癌肿是关注全体的,一般是从宏观角度慢慢到微观的分子生物学角度,一定是会以器官影像学加上传统的细胞病理学为主体,以创新的方式方法相辅相成,而不是谁替代谁,这样才能更好把我们的筛查做好。

思勤医疗是初创型企业,致力于解决癌症早筛几大问题:第一,无创及泛癌种;第二,我们明确知道有或无;第三,如果在有的情况下,我们不但会说你是高风险或者有,一定要告诉病人癌症的部位在哪里,这是我们癌肿的溯源;第四,低成本,这样大多数人才能做筛查项目。

这个图大家都可能很熟悉,正常细胞癌前病变到第四期,癌症的可治愈期或者是最佳的治愈期应该是癌前病变到二期。目前传统的影像学、细胞学,多数检查出来的癌症一般都会在中晚期,晚期的二期甚至往后。我们希望能做到,是在一期、更早期检查到我们的癌症信号。

这是我们目前做的无创泛癌种早期筛查检测项目,我们最主要是以外周血游离DNA片段中的癌症基因突变为主题,利用我们的大数据和人工智能的算法判断是否有癌症,并给癌症受累器官的溯源我们需要10毫升的外周血,不需要冷链,就是平常一般的室温,送到深圳实验室,我们在20个工作日之后给您一个报告,结果中呈现癌症风险分值(CRS),如果是阴性,后面也不会判断组织的来源;如果是阳性很高,我们会告诉你最有可能受累的器官是哪一个或者哪两个,您可以针对性做检测。最底下是我们标准的送检流程。

我们不仅仅在实验角度进行各种优化和创新,各个环节都有我们算法的迭代。1.CRS算法目前是1.0版本,我们整个月更新为1.5版本,希望在两个月之后随着更多量数据的积累,变成2.0版本。我们在美国申请一个专利叫熵降噪技术,这是去年年中申请的,待会儿更详细跟大家分享一下。我们在美国申请第二个专利,叫(英文)。

对噪音去除算法,我们的目的很明确,希望在每一个核算基础上降低测序相关噪音以至于突变的信号,反而更加清晰或者更加早期能检测出来。我们内部引发了三种不同的算法:第一信息熵,第二对数乘积分数,第三对数赔积合分数。

研发,我们从模拟数据集开始。模拟的数据集,我们以ctDNA数据模拟,在73个基因上,每个基因有一个真实的突变,频率范围大概是千分之一到百分之一,数据的大小是17百万个碱基,而且我们是多次随机产生多个序列的数据。

这是一个总体的比较,三种算法对于模拟数据集ROC比较。橙色是信息熵的表现,蓝色是绿色是另外两种算法,这里基本上能看到蓝色,因为绿色已经被蓝色覆盖,两者很类似。

整体看得出来,从Prometer可以看出来信息熵的表现是明显要比后面两个好。所以我们的初步结论是:信息熵对于这样的task(音),performance更好一些。

这是从个体角度看得到,第一个是所谓的信息熵,蓝色的点是已知的图片,就是我刚才说的每一个基因里面至少有一个已知的突变,而绿色的是我们在1700万碱基模拟数据中检测出来的突变。可以看得到信息熵这一部分,可以看到蓝色的点最前面是按照表现最好的前200个位点集合在一起的,按表现做的列表,可以看到信息熵这部分大多是都是来自于蓝色的点,我们已知可以检测到的,而且比其他的位点还要好很多。但是看另外两个图,蓝色的位点散散放在前200Wangck(音)里面。这也再次验证我们刚才看的整体表现,其实信息熵远远好于其他另外两种算法。

我们把我们的算法放到了真实样本数据里面,我们用了亚洲肿瘤研究联盟已发表的数据,数据最主要是NGS全基因组突变数据,而且在这些基因组的数据之上,它们一定是在用另外的独立方法验证以后的突变数据。其中我们可以用到500多个突变位点,而且其中有88对不同的样本。

接下来我们看一下在每一个样本中它们的表现。同样的,你们可以看到在大多数的样本中,蓝色仍然是排在最前面,而个别的绿色排在其中,最主要的原因是我们前面的数据虽然说只选了500多个突变,但是这些是一定用独立方式方法去验证的。再往更前面的绿色,也有一部分本身是突变,只是没有被独立方法学所验证。

再回到刚才的无创泛癌种早期筛查检测项目来说,这是我们目前检测项目的ROC曲线,可以看到如果我们做到特异度92%的清一下,灵敏度可以做到72%

这里做几个案例分析。第一位是阳性病人,他本身是肺癌患者,很年轻。我们提前就知道他在接受化疗和免疫治疗,去年10月份的时候接受我们的检测,当时我们的CRS很明显的高,是4.8。我在说一下CRS最高的数是5,他当时是4.8,绝对的高风险。目前的状况,这个患者已经离世了。

案例二和案例三属于疑似病例,这两个稍微有一点代表性。第一位是20135月份检出乳腺实质性结节,之后每半年接受常规的筛查。201811月找到我们,想做思康宁检测,当时CRS2.30,提示中等风险。到目前来说,所有提示中等风险的人,我们一定让他们重复再做一次检测以明确,所以她201812月份再做一次检测,仍然为中等风险,所以我们在她持续的随访中,目前仍然是阴性,没有癌变。

还有一位是2017年本身接受过肺癌根植术,2019218日在我们这里做了检测,结果出来CRS2.4,提示中等风险。他刚拿到我们的报告,2919219日第二天,他的临床诊断报告也出来了,他是肺癌的骨转移,目前他随时在我们这里做随访。

第四例和第五例是主要是阴性的,这两个例子比较有代表性,我想跟大家分享一下。受检者第一位是之前被确认为有子宫内膜增生,20184月份做过CTC,阳性,报告拿给我们看,但临床一直没有诊断他为癌症。20192月份到我们这里检查,呈现为低风险。因为他对健康管理很积极,做各种各样检查,到目前为止没有诊断为癌症,仍然是阴性病人。第五例是曾经做过CTC,阳性特别高,他就比较紧张了,跑到我们这里做了检测,我们当时给他1.73,基本是低风险。他当时也不是完全相信,说为什么,也有各种各样的问题,但是到医院去做检查,没有任何症状,也做了影像学、细胞学各种各样的检查,也没有任何诊断。

这是我们的案例分享,十分感谢!

主持人:请大家踊跃提问。


提问:我有点不明白,您作为筛查,您的检测特异度可以达到99%,灵敏度60%,我比知道我是不是理解错的,你说我没得癌,我还有40%的可能性有癌?


张锋:对,我们也经常被问到这样的问题,我们临床上也会有医生跟其他人都有这样的问题。因为我们是做泛癌种,首先我们做泛癌种,整体的Prometers目前是这样子的。


提问:一般筛查都是宁可出假阳性,因为假阳性,虚惊一场。但如果一旦说我没癌,我就放弃了,我走了,结果半年后,癌发了,我死了。所以一般来说,筛查而言,我们都想追求高灵敏度,特异性低点都没关系,咱们是这样的?


张锋:对。昨天晚上还跟姚总分享了一下。从临床角度来讲,最好是都达到100%或者99%98%,这是最理想的,但是现实情况下没有这样的测试。我们也夸大,我们目前做泛癌种就是能做到这么多。我们另外有一个在美国的对标公司,它的performance包括用方法学跟我们不一样,但是他的performance,目前大概56%,而且只是做泛癌种的公司,它是针对肺癌,56%,而且特异性大概是98%。所以他们也是做泛癌种。

对的,从技术层面来说,我觉得还是有很多方面要继续往前再走,但从我们目能做到这样子,但是我们还有对不同的泛癌种,当然performance跟他们不太不一样。


提问:您展示了您的ROC,您的60%99%是这方面的。但是我觉得还是提高灵敏度,会是一个很有益处的点。


张锋:当然我们最希望还是两个都99%以上。


提问:您说现实中不可能。所以作为一个诊断产品和筛查产品,我们在优化的时候可能有不同的倾向性。您看您的蓝点选在下面,您选在上面会不会好点,比如说90%的灵敏度,当然特异性降到40%。您说我得癌,我赶紧再查,可能查出来就不是癌,但至少您说我没癌我放心,我90%的可能性我真没癌,我就放心,我不查别的。毕竟癌症检查可以有多种手段,医学检查从来都是这样,你不会依赖一个,我们都会多重做。


张锋:对,这是我准备要马上回答您的问题。从我们的角度来说我们是一个检测,我前面也说了传统方式方法也要相辅相成的,从我们目前来说,我们目前就能达到这样子。但是如果说结合其他的传统方法方式进一步确诊,那是另外一回事。另外这永远是一个平衡,从我们的角度来说,你说我们追求哪一个点,我说这是需要大家再看一下。

提问:张锋博士您好,我是圣庭生物的谢秋曼(音),我对你们的产品有几个问题:第一,你们的沉淀是无创泛癌种筛查,想请教一下你们的泛癌种大概包括多少种癌种类型?您刚刚提到算法整体的特异性、敏感性的指标都还相对不错,对于你们包含的这些癌种当中,有没有针对哪一种癌种有偏好性,比如说对肺癌、胃癌的筛查相对不错,对有些癌种,比如淋巴瘤的特异性筛查不是特别好。

第二,因为你们用的是CTDN,其实你们用到的数据是93特异性,我就想好奇问一下你们的精级怎么筛选出来的,跟你们的特定癌种有什么特定关联。


张锋:我先回答你第三个问题。我刚刚说的93的基因,是我们做算法的时候,不是说我们只看到93个基因,这是我们算法做研发的时候第一批做(英文)。

回答第一个问题,目前常见的肿瘤都在我们的筛查范围内。


第二个问题,对于不同的癌种,performance的确不一样。我们在肝癌种明显看得它的灵敏性、特异性远远要高,但是整体performance下来,灵敏性、特异性值是这样子的。但是对于其他的常见肿瘤,有另外一个肿瘤脑肿瘤,因为他有血脑屏障,所以那样的检测是比较低的。要说对于具体的癌种,performance是不一样的,是有一定的侧重点。

提问:你好,感谢你的精彩演讲。因为我是在医院工作,所以我还是比较好奇你的临床应用性。你说敏感性有60%几,我看到你的案例里面很多是肺癌患者或者体检的时候已经发现乳腺结节,按理来说这些病人会在医院做专门的器官检查,而你们一般情况下用算法圈定的时候,肯定是要有明确的病理结果或者是你们的数据结果。这样的话,你再做预测的时候,你的模型里面大部分用的是这样的病人,但实际上这种病人已经确定是癌或者说他已经检查出结节,其实这种人的筛查会让你的算法可能是对这部分人,因为他是来自这部分人,所以对这部分人比较敏感。你有没有接触过那种,就是他之前什么病都没有,他直接到你这里来,最后发现你这个东西确实能把它检测出来,你有没有做第二组分析,就是你对这部分人的敏感性是多少,因为在临床中这部分人才真正有价值。


张锋:从我们最早做研发的角度来说,我们不仅仅选了肿瘤病人,而且是有健康人的。而且健康人,从我们筛选的标准来说,它当时是极少数可能性会得癌症,所以我们不仅仅对于癌症。刚好我在这里举的是我们的典型病例,比如说第一位是有其他的原因到我们这里来,只是做了一个附带的检查。其实他想做免疫治疗之后的BTMB,他想看看我们这种方式方法能不能做BTMB,是这样的原因。因为我们明确知道他是肺癌患者,但是他的病理CRS是我们目前得到最高的,4.8。所以也再次验证了我们的算法,从这个病例来说,已经很准确了,这是我分享的第一个阳性的最主要的目的。

实际上有这样的患者,当时他认为他是健康人,到我们这里做检测,提示3点几。是有这样的病人,他现在在医院做各种各样的检查。但是目前结果还没有出来,所以我也没办法分享。


提问:所以我想问的是你所谓的敏感性60%几,在健康的人里面的敏感性到底有多少?在健康人,不是有癌症或者可疑结节的人里面,他之前没有癌症没有病,你做了你们所谓的检查之后,发现最后检查出来他可能有了可疑结节或者得了癌,这部分的敏感性是多少,有没有做过?


张锋:相对来说我们的数据比较少。我可以说一个数据出来,但认为这个数据存疑,这个数据相对来说比较少。

主持人:需要行业里面的人多一些玩家,才会有更多的答案,谢谢张锋博士。我觉得你们很赞,因为你们都提满三个问题,所以不需要主持人临时提问题了,给你们比心,掌声谢谢你们!

我们今天讲了很多基因应用,也有技术,现在我们觉得应该要来一场梳理和总结,所以接下来有请下一位嘉宾:可瑞生物CEO测序中国顾问谢兴旺博士!掌声欢迎!

谢兴旺:谢谢大家!特别感谢主办方的邀请。主办方安排的非常好,先讲了一些免疫的talk,然后又讲了肿瘤,到我这儿正好是肿瘤免疫。

肿瘤免疫治疗现在主要还是针对一些中晚期或者进展期的肿瘤,所以到我这儿的病人不需要纠结敏感性和特异性。如果把这些肿瘤免疫关注的患者送去做检测的话,我觉得应该都是在90%以上。

本来这个talk是测序中国的CEO来讲,但是由于他有别的安排,由我来演讲。

2019年初,测序中国发布了免疫治疗专题报告,我也帮助起草了,今天以这个报告为蓝本,来和大家一起分享一下关于肿瘤免疫治疗的一些进展。

这个领域讲起来压力非常大,肿瘤免疫的进展实在是太快了,我作为一个专门做肿瘤研究、关注肿瘤免疫的人,都非常疲惫要去关注这些新的进展。实际上,肿瘤免疫是历史挺漫长的学科,有100多年,但是真正取得进展是在最近几年,之前可能大家做了很多工作,但是都没有突破。

肿瘤免疫治疗现在有很多分类的方法,今天主要是从细胞和非细胞治疗肿瘤来分类。非细胞治疗,包括检查点抗体、溶瘤病毒、肿瘤疫苗(肿瘤相关抗原、肿瘤新抗原)、非特异性免疫刺激。细胞治疗,有CAR-TTILTCR-T

2018年的回顾来说,现在比较热的几个领域,就是细胞治疗,除了这个以外就是疫苗,也是研究比较多的。除此以外,第一条就是T细胞靶向的一些免疫调节剂,主要是现在大家都可能会有很多了解的PD-1PD-L1以及其他一些免疫检测点的抗体。下面还有一种非特异的调节剂,主要是针对一些IDO或者针对一些固有免疫的调节剂。由于时间的原因,我可能主要会介绍三个领域。

第一部分,治疗性肿瘤疫苗。

肿瘤疫苗的原理就是我们用一些肿瘤抗原,无论是肽的形式或者是肿瘤细胞类解物,免疫到肿瘤患者,他会被抗原递呈细胞摄取,扩增之后的T细胞会迁移回肿瘤的局部,去杀伤肿瘤,基本上原理就是这样的。

由于测序的发展,现在大家已经能够非常好地检测体内针对肿瘤来说免疫最强的一类抗原,就是新抗原。但是除了新抗原以外,肿瘤里面的一些抗原,还有一些称为肿瘤相关抗原,它不是因为肿瘤突变产生的,只不过这些抗原在我们肿瘤细胞表达,而在正常细胞中不表达。从免疫系原理来说,这里有一点烧脑,我就做一个简单的概括,就是机体免疫系统针对新抗原,它的免疫攻击能力会更好,这也是为什么我们现在一定要花那么大的代价去把新抗原测序出来,用它去作为疫苗,而不用那些我们已经知道的几百个肿瘤相关抗原,就是因为我们机体对肿瘤相关抗原已经有一些中枢性的免疫耐受,我们用这些相关抗原的疫苗是不能激起很强的免疫攻击的。

在这部分,我们简单总结了一下所谓新抗原和肿瘤相关抗原。

新抗原只因为特异性而产生的,只会特异性地出现在肿瘤细胞,这样的抗原和我们机体接收到的外来病毒抗原或者一些微生物的抗原是一样的,是我们机体会识别为异物的抗原,会用非常强的攻击力去攻击它。

而除此以外的肿瘤相关抗原主要有三类:第一类,过表达的抗原。也就是说,在一些正常的细胞有很少的表达,但是在肿瘤里表达的水平比较高。这类大家一看就知道它的肿瘤特异性不是特别好,用这样的抗原可能会产生很强的副作用。第二类,组织特异性的抗原。比如说在黑色素细胞上出现,因此我们攻击这些抗原去攻击黑色素细胞就不会损害其他的正常细胞。第三类,癌-睾丸抗原。这类抗原只在一些生殖系统或者胎盘上发达,除此以外其他任何的正常细胞都不表达,但是在肿瘤里这类抗原的表达比例频率会非常高,所以这一类抗原是我们现在肿瘤免疫治疗除了新抗原里最主要的一类抗原。

前面讲了很多,最终我们是要用这些抗原作为一种主要的免疫激活的成分,去刺激我们机体的免疫。有了这些以后,我们会通过各种形式的疫苗制剂方式,比如说合成的肽段、裂解的肿瘤细胞、核酸的疫苗,以及一些新的通过DC细胞沉淀的疫苗,通过这种方式把我们前面讲的不同类型的肿瘤抗原送到患者的体内。同时,为了帮助机体的细胞更好识别抗原,激起抗肿瘤的免疫应答,还会加一些所谓免疫佐剂来帮助激起更强的免疫反应。现在除了前面的一些元素以外,还会通过不同的递送系统,比如说现在有一些通过(英文)的形式,更好地递送疫苗,更长地去刺激我们的机体免疫系统。

从我们高通量测序技术广泛应用之前,实际上我们用来做疫苗的主要都是一些肿瘤相关抗原疫苗,之前有接近二十年的尝试。但是最终的结果在零几年的时候,有很多的研究就去总结前面很多年利用肿瘤相关抗原作为疫苗治疗的一个结果。大家可以看一下,(图示)这里面有一个不完全的统计,即便有的研究有一个统计学的显著性,但是可以看一下他的生存获益时间基本上都是非常的微弱。因此在零几年的时候有一个结论,认为肿瘤免疫失败了,那时候我们去研究靶向治疗。

现在因为有了高通量测序的方法,我们可以非常有效地去建立在肿瘤里由于突变导致的新抗原,新抗原有一个很重要的特点,就是免疫性很强,可以很好地被机体的免疫系统识别和攻击。基于这样的新抗原,可以用前面提到的各种肿瘤免疫治疗的疫苗方式来做。除了这种疫苗的方式以外,现在我们还有另外一种方式,直接在体外通过负载DC把一些新抗原特异性的T细胞诱导扩增以后再回溯到体内。后面,我还会在细胞治疗的环节提到,现在个体化的TCR-T,我们把它建立以后,通过基因递送的方法,大量地表达到T细胞上,再去回溯治疗,这些都是针对新抗原的。在这部分,我主要讲的是一些疫苗的策略,直接免疫或者在体外诱导都可以归为疫苗的治疗策略。

基于新抗原的治疗,大家一定听过很多好的例子了,这是例子是在nature同期发表的两个中的一个,我们通过测序、通过一些计算机的方式,去证明哪些方式是能够表达为肽段,而且能够被HI分子沉淀,最终激起机体的免疫应答。最终我们用一个合成多肽,把几十个预测出来的新抗原合成一个肽库,再加上一种免疫佐剂去进行皮下免疫,这时候我们在这一组黑色素瘤的患者里,我们激起了非常强的的抗原免疫,而且有非常好的临床控制效果。如果对这些进展期的肿瘤患者,单用新抗原有效性比较低的时候,我们去联合使用一些PD-1的抗体,可以很好地取得联合免疫的效果。这块我会在最后重点去讲。

除了刚才讲的肽疫苗制剂方式以外,还有一些现在大家认为可能更有前景的一些方式。比如说这也是在2017nature上发表的,用mRNA的方式去做抗原的一个制剂的方式。大家现在认为mRNA可能能够更好地刺激免疫系统更长地表达抗原。在这个研究里,利用mRNA新抗原的制剂模式也取得了很强的抗黑色素瘤的效果。

除了刚才讲的新抗原以外,最新的研究,是让我非常惊讶的研究。他们发现原来被我们抛弃掉的那些非突变的肿瘤相关抗原,这一群不是突变导致的抗原,而是肿瘤相关抗原,在这些患者里也激起了非常强的抗肿瘤免疫。当然,另外一组新抗原的肽,也是产生了很强的抗肿瘤免疫。现在我们也在说,是不是以前有些疫苗或者制剂的地方没有弄对,其实这种肿瘤相关抗原也能够取得比较好的治疗效果。总之,前面这一部分是关于疫苗,因为新抗原的疫苗现在已经非常热了,在很多公司也特别多,我也没有去做统计,因为时间比较紧张。

第二部分,也是大家很熟悉的,就是关于免疫检查点阻断剂。

我花点时间介绍一下它的原理,前面我们讲疫苗的时候也讲到了,一个肿瘤抗原要激起机体的免疫,需要一些抗原递呈细胞去把抗原肽呈递给T细胞,让它活化,但是呈递的时候仅仅抗原肽是不够的,T细胞去活化还需要一个第二信号,比如说有一些非常经典的CD28CD80的结合,以及CD40LCD40的结合,这是帮助我们T细胞活化的。但是机体的免疫系统经过这么多年的进化,有一个非常好的平衡机制,就是除了这些活化的第二信号以外,还有一些抑制性的第二信号。(图示)在图里划了红色箭头里的,比如说PD-1PD-L1TIGITCD155,这些抑制性的信号会在我们T细胞活化到一定阶段以后,这些抑制性的分子会出现表达,让我们的T细胞静寂下来。当我们生病的情况下,是我们机体去免疫稳肽,防止自身免疫性疾病的一个很重要的机制,但是肿瘤非常聪明,正好利用了这个机制,因为在肿瘤里会出现肿瘤细胞过表达我们的PD-L1的分子,这样的分子就会是一个很强的抑制性信号,即便我们的T细胞能够识别肿瘤细胞表面的抗原分子,但是因为有PD-1PD-L1的存在,我们机体的抗肿瘤免疫并不能很好地被活化,这也是机体去逃避肿瘤免疫攻击的途径。当然,华人科学家很骄傲,陈丽萍(音译)教授识别了这条通路,并且首创性地用了PD-1PD-L1的阻断剂去阻断,所以开创了肿瘤免疫治疗一个全新的领域。可以说,肿瘤免疫重新变得这么蓬勃,和陈丽萍教授的工作是分不开的。

目前,我们可以看到PD-1PD-L1通过很多的训练或者说真实世界的使用,可以看到对进展期的肿瘤有很好的治疗效果,当然它的应答率不是那么高,有的肿瘤高一点,可能最高的有40%-50%,常规是在20%左右,有的比较低的在百分之几。我们做测序的同行,可能对怎么去预测PD-1PD-L1的应答率已经非常熟悉了,可以用一些类似于TMB的方法、MSI的评分去评价,这里我就不讲很熟悉的部分。

目前PD-1PD-L1制剂已经有非常多上市了,包括有4个在中国已经上市,应该是之前很多抗肿瘤药物上已经完全没有见过的景象,就是中国一个抗肿瘤新药上市的时间和美国、欧洲没有差多少时间,这是第一个没有想到。第二个没有想到,差不多在同一个时间节点还有国产的药齐头并进地上市,包括君实和信达两家现在都已经上市了,而且一看价格的话要比国外的抗体优惠很多。而且,随着现在越来越多的入局者,将来免疫形态抗原的治疗成本会不断下降。

(图示)这是2018年一个很好的回顾,去看基于检查点抗原的研发,在各个肿瘤里全球布局的一个情况。可以看到,增长是非常的明显,这是2017年的情况,可以想像2018年、2019年的增长会更加的明显。其中最主要的是单一的肿瘤,就是Lung cancer,它是目前检查点抗体无论是单药还是联合治疗,去研发布局最多的。另外,我们可以看到一个最高的Advanced cancer,其实我们不分肿瘤的来源是什么,仅仅凭它的一些分子分型,这也是在之前的治疗里不是特别多见的。这就是关于免疫检查点治疗的进展。

第三个部分,细胞免疫治疗。

前面我们讲的这些差不多都是围绕着T细胞为核心来进行的,无论是用疫苗去激活T细胞也好,还是用检查点的抗体让T细胞更好的工作也好,都是在体内帮助自身的T细胞更好的工作。第三个环节中,细胞免疫治疗就更加的简单粗暴直接了,原来你自己的T细胞不够用,我在体外加工改进以后,非常粗暴地给你回溯回去,我们非常直观可以理解到,比前面的两个策略有更加强的效果。

其实最早的细胞免疫治疗,先驱人物是美国的一位教授,主要是在黑色素瘤的患者里,他们应该是做了将近有几百例。因为黑色素瘤在体表,而且瘤体比较松软,所以说比较容易就能够把肿瘤的标本切取出来,然后在体外很好地去裂解它以后,用CDR3的抗体去刺激这个T细胞,让它克隆扩增,然后把肿瘤里的一些肿瘤特异性的T细胞大量扩增,同时让它的功能一定程度恢复以后回溯给患者,在黑色素瘤里取得了很好的效果。但是,我刚刚讲的方法讲了两个先决条件,第一是黑色素瘤在体表,第二是黑色素瘤非常的松软,因此我们去获取它的肿瘤浸润的T细胞比较容易,但是在其他的肿瘤里我们就做不到了,因为有的肿瘤我们取不到它的肿瘤标本。我做肝癌的比较多,因为肝癌的标本有时候是肝硬化了,里面都是特别硬的组织块,你去研磨根本就拿不到特别多的T细胞,因此TIL这种方式很难推广到大范围的临床应用。

为了弥补TIL的缺陷,后来有人就想到了,不就是要T细胞去识别肿瘤抗原,然后去杀伤它吗?我们自己的肿瘤细胞里的浸润T细胞拿不到,我们在体外人工去加工构建就可以了。所以说,现在出来了两个主流的,当然最火爆的是CAR-T的细胞。这个思路非常粗暴也很直观,就是在体外扩增大量的T细胞,并且给每个T细胞都装上一个能够识别和攻击抗原的受体。CAR是一种非常聪明的设计,就是我们把一个抗体上面的一个识别抗原的可变区装到T细胞上,同时给它加上一些能够传递T细胞信号的序列,让本来不识别肿瘤的T细胞通通都获得了一种识别肿瘤的特性,所以说CAR就可以识别肿瘤细胞膜表面的膜抗原。比如说,后面会提到的CD19,我们可以去识别这样的抗原,同时活化T细胞去攻击和杀伤肿瘤。

另一方面,其实T细胞更天然,前面有两位嘉宾都讲到了TCR的扩增和测序,为什么?就是每个T细胞里都有一个TCL,它的主要功能是用来识别各种的抗原,包括肿瘤抗原。因此,另外一种形式的基因编辑或者转基因的T细胞,叫做TCR-T。说实话,本来T细胞里就有的这种结构的T细胞受体转到我们的T细胞里,让它去识别和攻击肿瘤。这里面有一个很主要的区别,就是CAR的识别抗原的地方是从抗体来的,因此它只能够识在肿瘤细胞膜表面的抗原,这个特征非常重要。而TCR能够识别分子呈递的抗原,而这个抗原肽主要是由蛋白酶体降解细胞内所有的蛋白,只要你表达的蛋白,最终我们被标记以后,送到蛋白酶体处理,它降解的肽都有可能MAC分子呈递。因此T细胞能够攻击的靶标是非常多的。

(图示)这是CAR的一个结构的进化,我就跳过了。CAR目前在临床上推的最成功的就是针对B细胞的白血病,主要是三个抗原,最多的当然是CD19,为什么?CD19能够覆盖分化程度最多的B细胞,当然现在也有CD20或者CD22靶向。目前有两个大家都知道的,两个商业化已经上市的产品,一个就是诺华推的Kymriah,售价47.5万美元,还有一个是KITE KTE推的C19/Yescarta,售价37.3万美元。

刚刚讲的商业化是血液性的肿瘤,在实体肿瘤有很多在做尝试,尤其是中国的企业也好,研究者也好,在实体瘤里是最激进的,尝试最多,我们可以看到很多的靶点主要是中国的科学家在推进。但是,如果我们去看统计的话,美国的科学家真的去做实体肿瘤的CAR治疗还是偏少的,为什么?因为我们前面讲了一个特性,CAR只能识别肿瘤细胞膜表面的,而我们这里所有给出来的CAR可以攻击的靶点都有生理功能,无论是HER2,还是GPC3,还是其他的,所以说我们用这些有生理功能的抗原作为CAR靶标的时候,难免会产生毒性。

当然除了前面讲的以外,CAR现在还在往另外一个方向发展,就是通用型的CAR。我们用捐献者的T细胞,把上面能够引起GVST内源的T细胞,我们把它敲掉以后,就可以把T细胞做成为一个通用型的T细胞,将来就是一个细胞药。这块最主要在推进的是一个法国公司,中国有非常多的创业公司都在做这方面的尝试。

前面讲到的是CAR,我们提到一个特点就是它好像在实体肿瘤里好像是比较困难的,但是TCR-T在这个领域里是如鱼得水,是专门为实体肿瘤而生的,目前已经有一些临床治疗的结果。比如说2018年,在滑膜肉瘤里,有20例患者用一个T细胞取得了50%2015年在多发性骨髓瘤里,有80%的患者都产生了可持续的抗肿瘤的效果。因此,有很多专家都说TCR-T目前是实体肿瘤最主要的治疗选项。

我们公司最主要的研发就是用刚刚前面同行提到的一些类似于TCR测序的方法,去获取大量的天然TCR,主要是针对相关抗原,因为相关抗原在人群里表达的频率比较高。所以说我们用相关抗原作为靶标的话,每个TCR适应症会比较广。但是,相关抗原有一个缺点,我们机体的免疫系统对它有一个先天性的免疫耐受,因此这样的TCR抗肿瘤的活性不是那么高,这也是为什么前几十年的时候,相关抗原的疫苗不管用的重要原因。

因此,我们要做一个很重要的工作,就是把那些天然的TCR,它能够识别某一个抗原,但是信号力不够,抗肿瘤效果不强,我们去做一个蛋白信号力的进化,把每个TCR都变成一个亲和力更高的,能够去识别和攻击抗原的这么一种亲和力优化以后的TCR,同时还能够保证它的特异性。有了这样的一些TCR以后,就能够把它转导到T细胞上去杀伤表达这些肿瘤相关抗原的组织。我们公司目前是在大量优化这样的TCR,我们希望能够结合通用T细胞的技术,去建立一个通用的TCR的细胞库,在这个细胞库里,每一种细胞能够识别一种肿瘤抗原。将来我们的目标产品阶段就是我们可能有几十种不同的通用型的TCR的细胞,对患者进行检测,主要是检测两个:一是HRI(音译)的分型,二是检测一些常见的肿瘤相关抗原的表达,从而去匹配,如果能够匹配上的话,可以用单个克隆或者多个克隆去输入,从而治疗肿瘤。这是一点私货。

除了刚才讲的我们做的通用肿瘤相关抗原的TCR以外,还有一类也是非常热的,就是个性化的TCR。个性化的TCR,主要的靶标就是肿瘤新抗原,我们通过一些方法把这种能够识别和攻击新抗原的TCR分离出来,表达到T细胞上,从而治疗肿瘤。

(图示)这是一个例子,通过它们建立分离新抗原特异性的TCR,然后转导到T细胞上回输,取得了非常好的持续的抗肿瘤的活性。

刚刚讲了两类,一个是肿瘤相关抗原的,一个是新抗原的。新抗原的抗肿瘤活性非常高,不用做亲和力的改进,但是我们每个人都是个性的,因此每个人都要重新去走一遍TCR测序,当然现在有很多公司在着力建立这个流程。如果像我们这样的公司去做肿瘤相关抗原的T细胞,只要优化一个受体就可以在10%,甚至在20%的实体肿瘤里广泛使用,这是两者的主要区别。

(图示)我前面讲的主要都是T,但是除了T以外,还有一些NK或者NK-T,以及其他很多形式。在T里,当然最多的就是CAR-T,可以看到753项细胞免疫治疗里,CAR-T占了404项,TCR-T占了80项,所以以T为核心的细胞免疫治疗还是目前的主流。

我们再来看看抗原的分布,有一点失望,CD19是最多的,所以有很多重复的工作。从产业上来说,国内大量做CD19靶点的企业,未来肯定有一些被挤掉,因为大家的同质性太高了。

(图示)这是TCRCAR在全球的格局。可以看到,在中国主要是以CAR为主,203项里CAR占了绝大多数,在美国CAR大概占一半。有一个很重要的原因,构造美国做实体肿瘤的CAR比较少,但是美国的TCR-T要多一些,因为它的难度比较高,目前国内进入TCR-T行业的企业不是特别多。

第四部分,融瘤病毒。我个人是比较看好的,因为溶瘤病毒和肿瘤免疫治疗是一个非常好的搭配。溶瘤病毒是通过一些分子机制的设计,让我们的病毒感染机体之后,选择性地在肿瘤细胞里去复制,而在正常细胞里因为有一些酶的缺陷,不能在正常细胞复制。因此我们可以选择性地在肿瘤里复制,去裂解肿瘤细胞。裂解之后,可以通过T细胞的致敏,促进T细胞的浸润,解除免疫抑制,促进抗原递呈等一些方式,去促进机体对肿瘤抗原的反应。

(图示)这是一个例子,在肝癌里有一个基于牛痘病毒的JX-594,在肝癌里产生了一个非常好的活化抗肿瘤免疫的过程,也有非常好的临床应答。

溶瘤病毒大家听的稍微少一点,但是它的临床项目非常的活跃,而且很多是和PD-1联合的治疗。

最后一部分,肿瘤免疫治疗的趋势与展望。

最主流的趋势就是联合治疗,这里面是总结了和检查点抗体去联用的情况。(图示)左边的图是不同的检查点抗体分别和其他的免疫治疗或者说其他的泛化疗联用的方法。可以看到2017年、2018年,就是最下面灰色的部分,这是单药,可以看到每一个PD-1抗体,单药用的比例已经非常小了,更多是联合应有。这也是有人在总结免疫治疗的一个特点,就是将来检查点抗体一定会成为我们治疗的基石,会和大量其他的治疗联合应用。右边的图可以看到,如果和检查点抗体联用到底是哪些东西?最多是另外一个检查点,CTL-F,实际上这不是特别的合理,只不过它出现的比较早。同时,我们可以看到和化疗、放疗联合应用,以及和靶向治疗的联合应用。从这部分可以看到联合应用一定是将来的趋势,而且检查点抗体是一个基石。

(图示)这是一个例子,是进展期已经到四期的黑色素瘤,这是一个免疫学检测,如果单纯用新抗原不能引起有效的抗肿瘤免疫,如何联合PD-1的抗体之后,能够激起非常强的抗肿瘤免疫应答和很好的临床效果。

(图示)这是溶瘤病毒联合PD-1抗体治疗肺癌。溶瘤病毒是免疫治疗的一个很好的榜首,这是2017年的一个研究,当溶瘤病毒和PD-1抗体联用以后,可以非常强地提高治疗的应答。

(图示)这是细胞治疗,它有很多的实验在评估,无论是CAR-T,还是TCR-T,还是TIL以及一些其他治疗方式联用的效果。前面讲的是一个主要的趋势,联用。

第二个趋势,是我们基于生物标志物的辅助,这可能是在座的同行比较专业的部分。这里有一个非常好的决策系统,就是我们通过一些免疫学的检测或者NGS的检测,很好地对肿瘤患者做一些免疫的分析,然后去对应的比较好的免疫治疗的方式。

最终,总结一下。抗肿瘤免疫治疗是非常有前景的,有一些特点:特异性好、作用强、普适性、记忆性。现在PD-1抗体的单用,能够让10%-20%的患者生存时间更长,将来通过联合免疫治疗,能够让越来越高比例的肿瘤患者,更长时间的带瘤生存,而且生存质量更高。

以上是我的报告,我会做一些新抗原的治疗,主要是研究TCR-T。谢谢大家!

主持人:感谢!感谢谢兴旺博士,他把这个产业说得非常清楚,因为时间完成,我们就不给大家留提问时间了。感谢,再一次掌声献给谢兴旺博士!接下来的环节献给为这个产业做服务的超凡知识产权公司的潘浩先生,他为大家带来精彩的分享,掌声有请!

潘浩:大家好,我是超凡知识产权的潘浩,感谢郝向稳同学给我机会,跟大家聊一聊知识产权的事情。因为我是十几年前就离开基因行业,但实际上我也一直关注基因行业的发展,因为我之前做十年的专利审查,这期间我审查过基因检测方面的专利不下100件,所以我也看到行业成长、爆发的过程。我十年前看到国内申请基因检测的万里,往往都是眼窝、试剂盒、探针方面的专利,保护范围低、用户小,而且力度不是特别大。当初看到国外公司申请的专利,是用DNA来传递情报,所以当时感觉特别脑洞大开。但实际上这几年,我感觉国内的申请人、国内企业脑洞大开的专利和开创性的专利越来越多了,所以今天想从这个角度来讲,因为实际上我通过知识产权,我可能没有投身基因行业,我也会见证这个行业的成长。所以从这里可以看出基因和聊知识产权不仅仅是一个法律武器,同时还是一个信息的工具,就们可以通过聊知识产权、专利,来了解这个行业技术的比较情况。

之前郝向稳同学给我的题目很大,就是《肿瘤免疫治疗技术专利分析》,这个工作要做好至少要几个月的时间,所以没有办法说,只能从CAR-T领域抽取一小部分的样本,实际上就是抽取诺华公司的专利,对他们的专利从专业布局的方向做一个分享。为什么选诺华公司呢?因为他们是CAR-T技术领域的龙头企业,他们是这个领域的老大。

CAR-T技术,很多人都了解了,我不多说,这个领域主要有三个选手:诺华、JUNOKite公司。

这几个公司实际上并不是一开始就入局CAR-T领域,最早通过对专利申请人的分析,可以看出三巨头公司的专利申请主要都集中在2013年以后。在此之前,这个领域的专利实际上大部分尤其是基础专利,大部分都掌握在研究机构的手里面,实际上它们都最早通过专利许可的方式,先得到他们的许可研发,再进入这个领域。所以为什么会形成今天三巨头的格局?除了商业和市场的因素以外,背后涉及了一系列特别复杂的专利许可、机构合作和专利诉讼。

实际上从专利许可角度来说,诺华最早获得了JUNO的几种发明专利,JUNO实际上获得了康德、儿童院、MSK研究中心的专利,Kite公司是从好几家企业和研究机构一共获得十多项专利的许可。实际上从Kite从当年的年报可以看出,2016年年报一共有100多页,但是里面提到专利许可200多次。所以说专利许可,是这些巨头公司进入这个行业的前提条件。他们之间的关系除了许可、合作以外,还进行了非常重要的交锋。

第一场非常重要的交锋是属于诺华阵营和JUNO两家之间的对抗。最早的时候,是儿童医院开发出了针对CD19的抗原受体,和bingnike(音)进行合作开发,bingnike开发出一个针对CD19的抗原受体,最后双方为知识产权归属发生了争执,所以2012年终止合作协议,开始了诉讼的过程。实际上最重要的事情是2013年的时候,圣裘德医院发生了最右上角的645B2的专利,在美国获得了授权,这个专利是做CAR-T领域人都知道的专利,是非常重要的,它是所有二代测序技术的基础专利,保护费的范围非常大,非常难以越过。所以它当时出来的时候,可以说是对CAR-T市场、CAR-T技术市场格局有非常重大的影响。所以说专利授权才3天,bingnike就对它提起了诉讼,宣告他的专利无效。这个过程比较复杂,时间关系不多说。最终诺华、JUNO在这里入局,双方达成和解,最终诺华支付1200万美元费用,还许诺产品上市以后的分成。

另一场比较激烈的冲突是kite公司和JUNO公司之间的,最早kite公司2017年被GILEAD119亿美元的价格收购了。但是发生一件非常奇怪的事,收购以后JUNO和它是竞争对手,他们的股价不仅没有下降,在两天内涨了40%,这个现象比较奇怪。究其原因是当时JUNO公司在几年前获得了MSK公司190号专利许可,而这项190号专利保护范围完全覆盖了Kite公司KTE CT19产品,也是CT19CAR-T产品,它覆盖了它的产品。所以当时在2016年的工作,JUNO公司就对Kite公司行起侵权诉讼。所以JUNO公司的股价上升,也不是没有原因的。但实际上Kite公司也意识到他们的专利侵权,诉讼是没有办法避免的,所以他们在2015年的时候,就抢先对JUNO公司的这项专利提出无效请求,就是说这场专利战到目前都没有一个结局。

我为什么要讲这些专利战和专利许可?因为这里涉及到的专利权都是这个领域最重要的专利,每一个研发,想投身于CAR-T技术研发的企业也好,个人也好实际上这些专利都需要仔细研究和仔细考虑的。因为我们平时可能很多人都觉得我的专利授权以后,它可能就非常好了,但实际并不是这样,因为专利授权只是第一步。同样的技术,专利保护范围可能大,可能保护范围小,结果都不同。像这些可以经过诉讼,可以经过许可,而且在诉讼中活下来的专利是属于经过千锤百炼考验的。所以他们的专利到底怎么撰写,里面的实验数据是怎么提供的,实际上是特别需要我们学习的。

非常巧的是因为跟向稳总确定汇报题目以后,没过几天我发现欧洲专利局审查员发表了一篇关于CAR-T技术专利分析的文章,这篇文章里面已经展示了专利分析的可行性和专利分析的价值。当然,不过这片文章分析的内容都是从宏观的角度上分析的,像这种比较宏观的技术趋势,实际上我们通过其他途径,相对来讲是相对容易获知的,所以给各位带来的参考意义不大,所以我简单展示几张图片:这是专利申请量的趋势,红色表示专利申请数量,蓝色表示专利家族的数量。这里解释一下什么叫专利家族,专利家族就是说把专利按照它的优先权等信息归并,归并以后得到的一组专利就叫专利家族。比如我们申请一个国际申请,进入中国、美国、日本三个国家,最后得到四项专利,最后得到专利家族。这一个专利家族,实际上反映一项创新。所以从图中可以看到2012年以前专利家族的数非常少,CAR-T领域的创新量并不大,但是从2013年开始就有了非常快的爆发,而且增长速度一直非常强劲。

所以当我们看到一项技术,它的专利申请趋势体现出这样的一个图形的时候,这旧体诗我们这个技术不仅是一个市场前景很好,而且它可以不断产生正向结果、有价值结果的技术,这样的话才能刺激人们投入越来越多的资源里进行这方面的开发。

下面这张图是专利布局地目标国的排行。从这边可以看出人们对CAR-T技术在海外的布局是非常重视的。可以看到上面W指国际申请,国际申请数是最多的,也就是说CAR-T技术开发出来以后,每个人首先想到的是要布局到海外进行国际布局,最重要的市场就是美国,跟技术起源也是有关。其次就是中国、欧洲、澳大利亚、加拿大都是大家比较重视的市场。下面这张图是对企业申请人排名,实际上从图里可以看出诺华确实是这个领域最重要的创新主体,第二名是一个法国的公司,实际上它是做通用型CAR-T技术,这几年特别火,它排名是第二。前十名里面实际上并没有三巨头里面的其他两个巨头,主要是因为他们的专利、技术大部分是通过许可获得,自己真正研发或者获得研发的并不多。前十名里面,大家可以看到实际有五家都是中国企业。所以从这个角度来讲,中国企业进行CAR-T的研发已经进入了第一梯队。但我们还要注意一个现象,就是说我们看右边的专利数、左边专利家族数,用专利数比专利家族数,可以看到外国公司比值是三四五六,而中国公司可能就1112的比低。所以从这里可以看出国内公司CAR-T技术的海外布局,实际上意识还是不够强的。整个国外公司,它在布局海外的时候,一个发明出来以后,会布局3-8个国家或者地区,而中国往往布局一个国家或者两个国家。

下面我就想讲一下专利布局方面。作为企业的研发人员也好,或者说想引进专利也好,当我们作出决策以前,我们一定会对我们项目、我们的研发方向做一个总体调查,我们会通过各种渠道的信息来源,来熟悉大量的信息,来帮助我们做出决策,尤其是有些企业可能会想涉足原本不是那么熟悉的领域,这个方面的工作实际上是特别重要的。从技术方面来讲,我们觉得需要了解这个领域整个技术发展情况是怎样的、竞争对手都在做什么,还包括这些技术可能会遇到哪些难题,大家怎么解决这些难题,都是我们想要发现的地方。

以靶点为例,实际上这也是对诺华公司进行的分析,因为它确实是这个领域绕不开的非常核心的选手。以靶点为例,我们先调查了传统的信息渠道,也就是说发表的论文、临床实验数据、财报和企业的年报等方面的数据,我们发现诺华是在CAR-T技术上布局了6个靶点,其中最重要的就是CD19,这是三个巨头都在开发的靶点,可以说做的竞争对手太多了。其次是间皮素,间皮素是仅次于CD19临床数据的第二块及再是CD22EGFR等,很多都比较类似。当我们了解足够的情况之后,我又对诺华公司的专利进行了检索,结果发现诺华公司至少在CAR-T领域至少布局了12个靶点,除了我们从临床实验数据报道里面看到的以外,他从专利里面还布局了6个靶点。如果再加上专利中比较次要的靶点,实际上它真正布局的靶点多达几十个。看靶点相关专利保护范围实际上都非常大,虽然现在没有授权,但至少可以看出他们想要的目的,确实是想有可能在这些靶点领域里面继续深挖。所以说这些靶点,这里面每一个靶点十年以后,实际上都有可能会开发出一个能够上市的产品,而且就算它不上市,也会对其他的选手进行相关开发的时候造成障碍。所以从这里可以看出,如果我们做调查项目也好,或者说我们选择研发方向也好,我们的专利信息是我们一个不可或缺的一环。就是说我们只有把这些信息全部掌握全以后,我们才能知道企业到底在关注什么、它在做哪些工作。如果我们对这些信息不够了解的话,有可能我们做了几年以后,突然发现这个公司某个靶点进行临床或者某个靶点进行上市,这种情况下实际对我们非常不利。

最后讲一下诺华公司在CAR-T技术上怎么布局的。这张图是一个比较常见的CAR-T技术可以布局的方向。最直接的,我们可以对CAR-T本身的结构进行布局,包括CAR的结构,或者T细胞的结构,这方面出来的专利很多都属于核心专利、非常重要的专利。再有一个是我们可以往治疗用户这个方向布局,包括布局适应症、联合治疗之类的。再有是我们可以对它的生产环节,因为生产环节也有可能遇到各种各样的问题,所以包括载体、细胞制备方法和结构都可以布局一些点。我们还可以针对CAR-T技术没有解决的难题,可以布局相关的解决方案,这也是比较重要的思路,比如说安全性问题。

诺华公司怎么布局的?这是他们现在CAR-T方向的专利随着时间的排布。从这里可以看出他们最早的布局方向、最初的布局方向是靶点开发、CAR结构的改造,其中最重要的是针对已知的CAR-T靶点来布局性能特别优异的结合结构域,这也是跟研发的思路和当时的市场情况有关。因为结构结构域是他们未来很多工作的基础。而且这些靶点都是大家已知,大家都盯着的,就看谁强,所以大家都会往这方面布局。当他们的开发和布局取得一定成果以后,就可以看到他们的布局范围扩大,开始往治疗方法扩展,包括T细胞亚群调节、使用增强剂、联合治疗等。与此同时它还开发了三个纯粹的新靶点,是他们自己的。在他们的靶点方面有了一定储备以后,我们又可以看到它2016年时候的申请,它的研发方向又变了,又调整了,从靶点开发方向开始转向应用和优化方面的技术,主要是联合治疗、细胞处理、评估方法这方面的专利。为什么往这些方面转?实际上它就是为了从多个角度,多方位对它的产品进行保护。如果我们仅仅保护产品的话,如果我们效果特别好,就很好,但对竞争对手来说会想方设法进行改进和优化,来提高他自己的效果,所以我们也不能放松这方面的开发,而且要及时布局专利。这里面的专利尤其是细胞处理方面的专利,虽然看上去都是生产制备过程中的东西,但实际上保护范围非常大,这里涉及到生产过程的专利,比如说别人想偷偷摸摸做的话,也是比较难的,因为有的时候我们可能会希望觉得方法专利保护力度小、不好举证,但实际上也有一个原因是我们的保护范围有时候太小了,所以别人可以轻而易举提出一个证据,就把它绕过去。所以对于诺华公司的专利,大家可以看一看,基本上这些专利可以属于平台性的技术,保护范围又大,而且应用领域又特别广。

所以到了这个时间点,诺华已经构建起了一个多方位、交叉立体的保护网,这时候他就可以进行其他的研发,然后可以看到诺华公司以后又开始了新一轮的靶点开发,同时还有治疗方法和细胞处理,这些也当然是它布局的重点。

我们再换另一个角度,从技术难题的角度出发看它是怎么布局的。它的技术难题可以分为三类:增效问题、安全性问题、细胞制备问题。它关注最多的是增效问题,尤其是持久性问题,可以看到它布局了一系列非常多的方法,其中就包括联合治疗,联合治疗也是谢总说的大家比较看重的方面。但实际上诺华布局的联合治疗,不仅仅是把CAR-TPD1PDL1进行使用,不仅仅限于免疫检查抑制剂,还跟其他的靶点抑制剂做了咬合。再有是增强剂,还有T细胞亚群结合,还包括评估方法的有效性。其次关注增强方面是抗肿瘤活性,主要是通过联合治疗,再有是对细胞进行遗传修饰等方面进行增效。另外,诺华公司实际还通过细胞的遗传修饰,把它的适应症扩大了,扩大到自身免疫疾病的方向。另外一个关注点是安全性,安全性是比较集中的,主要是通过CAR结构的各种改造来降低它的脱靶效率,来降低细胞因子的活化。在细胞制备方面,现在看来它实际上比较关注T细胞如何分离、如何扩增方面的专利,它相对重视一些。

下面再看一下诺华的CAR-T技术和CRISPR技术的结合情况。因为CRISPR技术实际上大大方便了我们进行细胞编辑的工作,所以说大家普遍把CAR-TCRISPR的结合非常看好,包括现在通用型CAR-T技术可能都会用到CRISPR。诺华在这方面也是布局了不少的专利,其中包括四项是利用CRISPRCAR-T进行细胞遗传修饰,还有三项发明是把CRISPR作为其他靶点的抑制剂,以CAR-T疗法来进行联用。同时还开发了一个专门的CRISPR试剂胞内递送系统,还开发了CAR-TCRISPR系统。

从保护产品的角度,来讲一下诺华的专利布局是怎么构成的,就拿已经上市的Kymriah产品为例。图中黄点表示Kymriah的药。但实际上我们要想把这个产品很好地保护的话,我们就需要用专利把产品覆盖住,就是这个住里面的色块,实际就表示专利,色块大小就代表保护范围的大小。它怎么保护?第一道坎儿就是刚才说的645号专利,这个专利非常重要,它的保护范围很大,它是任何针对CD19的抗原受体,它主要是使用41PB共刺激信号和CD3信号,实际上都会进入这项专利的保护范围,所以这是所有开发类似技术的公司都要考虑的专利,一个很难跨过的障碍。诺华公司是通过几年的诉讼,最终以和解的方式解决了这个问题,获得了专利的许可。诺华公司不仅获得了专利许可,不仅解决了专利障碍,同时还跟他的合作公司、合作机构还获得了上面几项专利,这也是两个保护范围很大的基础专利,获得这两个基础专利的独占许可。而且在此基础上他还开发出自己一系列的性能非常好的CD19的结合结构域,实际上通过这些专利,就很好地把产品保护了。但实际上这些还不够,它还是从应用优化方向布局了一系列,包括CAR结构改造、治疗方法、细胞处理各个方面的专利。这样做的好处,就是我形成这么一个立体交叉多方位的保护网以后,一方面可以阻碍竞争对手从各个角度,阻碍它进行优化,因为我们的保护范围大,所以如果对方想进行优化,很容易侵犯我们的专利权。再有一个变化,即便竞争对手真的开发出了性能非常类似或者性能更好的产品,实际上我们也能很快推出一个新的改进型的产品,去跟它对抗。因为新的产品完全可以利用现有的专利架构,得到一个很好的保护。就像刚才那个图里面的基础搭建完以后,如果我们再开发出其他的靶点,之前的那些优化和应用方面的专利,包括一些特别重要的技术专利,实际上我们还是可以利用,它们同样可以保护我新的靶点。所以我每出来一个靶点,它得到的都是一个立体交叉的保护网,而不仅仅是一个单独的专利保护,所以保护力度是非常强的。

下面看一下大公司专利布局方式。图中的点也表示申请人的产品,他在布局的时候并不进行检索,仅仅是通过自己的感觉,把它一层层扩展,扩展出很多层,就感觉构建出了一个多层次的保护。在这个基础上,他又进行了各方位的拓展,最终形成这样的专利。这里为什么这么布局?实际上有很多人有一个误区,就是说他把产品跟专利之间的关系简单一一对应了,比如说我们一件产品一件专利,仅此而已,没有想到各个专利之间的交叉规律。所以说这是一个非常典型的布局,就是说我后期所有的一切都是围绕这个核心的产品进行布局,可能就布局了一个专利,写了这样的保护范围。这么做有什么后果?就是说首先我是对现有的情况不了解,或者说缺乏了解,将来审查员在审查过程中,可以使用什么样的证据来应对审查,我没有预案,所以我只能被动等着审查意见。如果这时候审查员找到一个比较好的对比元件或者范本,那么我之前想的保护范围都没有意义,我的核心保护范围一下子就缩得很小。而且在核心保护范围缩小的同时,实际上其他往各个方向扩展的保护范围会随之缩小,因为它都是围绕你的核心产品布局的。所以最终会得到一个非常小的保护范围专利。即使以后申请很多件专利,每个产品一件专利,仍然是一个很松散的一群专利,并没有形成一个保护网。所以对于这样的专利,竞争对手很容易绕过,随便改一下就可能绕过去了。

通过这两个例子对比,我们应该怎么做,才能构建出一个比较有的立体交叉保护网络?实际上可以通过三个方面来做。首先我们可以从事专利分析,来帮助我们了解整个技术领域现有技术的情况是怎样,我们要知道哪些地方属于专利密集,哪些地方是专利系数的情况。通过这样情况,实际上给我们研发决策者提供了信息,来帮助我们规划或者帮助我们调整我们的研发方向。当我们形成了一定的技术成果以后,实际上我们要想撰写申请专利的时候,我们进行充分的检索工作,就是说我们会对我们的技术方案进行检索以后,根据检索结果再调整我们的技术方案,增强我们的实验数据,再检索再调整做补充数据。不断的过程,最终才能获得一个特别合理的保护范围。再有是注重多角度的改进,从各个角度对它进行改进,而且改进的时候要形成平台性的技术,就是说我改进的时候考虑的范围宽一点、广一点,不要仅仅局限于核心产品,因为局限于核心产品的话,产品的保护力度是有限的。所以当我们做出这些工作以后,我们就有希望拿出一个高价值的专利组合。

刚刚讲了布局,现在介绍一下CAR-T技术跟测序技术之间的结合问题。我们也检索了相关专利,但发现测序技术在CAR-T领域中的应用还是非常有限的,因为测序只是作为一种工具,用在CAR-T中某一个步骤,没有用测序技术来解决一个特别关键的技术难题,这一点还没有做到。目前两者结合的应用,绝大多数都是在CAR-T细胞的制备过程中,有少量是用于CAR-T技术的开发,有一些少量应用是在个性化医疗和疗效预测、回输控制方面。期待以后未来CAR-T技术和测序技术能碰撞出更大的火花。

谢谢大家!今天讲的内容主要是这些,如果大家对聊知识产权感兴趣的话,可以加我的微信,右边是我个人微信,左边是我们的知识产权课堂,里面会推送很多东西。


主持人:谢谢潘老师给我们带来的精彩演讲!今天下午我们嘉宾分享环节到此结束,一个小时之后我们相约在这里。接下来一个小时是大会创新开发者之夜的party,会给同行业优秀企业家和科学家的颁奖典礼。所以一个小时之后,我们相约在这里,我们每个人带走自己的物品,服务员会来清理。谢谢大家!谢谢大家今天一直坚持在这里,掌声送给你们自己,也送给你们的主持人,谢谢!

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