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上次分不清几种基因修饰小鼠的人已经凉了

首页 » 研究 » 组学 2018-08-30 生物学霸 赞(7)
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导读
动物模型作为医学及生命科学研究中不可或缺的研究工具,其中结合基因编辑技术制备的【基因修饰小鼠】拥有许多类型,包括转基因、基因敲除、条件敲除、点突变、基因敲入等。

转基因小鼠

基因过表达研究好能手


转基因小鼠常用于基因的过表达。根据制备策略,分为随机转基因和定点转基因。随机转基因是将过表达载体注射到受精卵中,表达载体以随机方式插入基因组,首建鼠可能有多个位点插入,每个插入位点可能含有多个表达载体拷贝。这个特点导致有的转基因小鼠会发生表达沉默,因此需要对小鼠进行表达筛选,筛出正确表达的小鼠,进行建系才能用于后续实验。定点转基因是将基因表达载体插入到基因组特定位点上,如 Rosa26 位置,研究证明,这个位置不容易发生表达沉默,与随机转基因相比,优势是表达确定,但制备相对复杂,成本和周期增加。


图 1:转基因小鼠制备示意图

来源:Yale J Biol Med. 2011 Jun;84(2):117-124


基因敲除小鼠

费用逐渐降低


传统策略是通过同源重组的方式,用 Neo 基因替换或删除关键外显子来敲除基因,其周期长,费用高。TALEN,CRISPR 技术出现后,加速了基因敲除鼠的制作,而且降低了费用。CRISPR 切割 DNA 后,会引起的非同源末端修复(NHEJ),这种修复有一定的随机性,如果插入或删除非 3 的整数倍的核苷酸,会发生移码突变,造成基因敲除。移码突变的策略只需要单个 gRNA,但是后期检测一般需要测序,或者用分辨率更高的 Page 胶电泳,检测相对复杂,成本较高。


图 2:基因敲除小鼠制备示意图


这里有个需要注意的雷是某些敲除虽然发生了移码,但是蛋白水平检测发现,未能敲除目的基因。目前维通达采用双 gRNA 策略,删除关键外显子或整个目的基因,确保有效敲除目的基因,由于删除了一个大的片段,PCR 检测时,敲除小鼠很容易与野生型区别。


条件敲除小鼠

敲除致死的唯一模型


当目的基因敲除致死时,只能做条件敲除,常用 Cre-loxp 系统。那么如何操作呢?方法是在要敲除的区域两侧插入 loxp,得到的 floxed 小鼠与组织特异表达 Cre 的小鼠杂交,在 Cre 的作用下,两个 loxp 之间的区域被删除,可以实现在特异的组织敲除目的基因。条件敲除虽然也是敲除,但是制备这种小鼠实际是要定点插入 loxp 序列。


图 3:条件敲除小鼠制备示意图


点突变小鼠

可模拟单个碱基突变引起的疾病


某些疾病由单个碱基突变引起,通过突变小鼠的相应碱基可以模拟。CRISPR 打断 DNA 的同时,提供含有目的突变的单链修复模板,能够有效地建立点突变小鼠。影响点突变效率的主要因素是,该点突变附近有没有高效率切割 DNA 的 gRNA,如果有,是比较幸运的,如果没有,可以选取邻近的 gRNA,这可能造成二次切割,需要引入同义突变。在这里提醒大家,切割位点离突变位点越远,突变效率越低。


图 4:点突变小鼠制备示意图


基因敲入小鼠

制备基因人源化小鼠


CRISPR 打断 DNA 的同时,提供打靶载体,能够敲入外源 DNA。当需要敲入长度较小 DNA 片段时,CRISPR 能够有效地提高效率,如维通达制作的免疫检查点基因 PD1,CTLA4,Tim3,和 LAG3 的人源化小鼠,都是通过 CRISPR 技术,将小鼠的基因替换成人源的基因。对于 GFP 等各种标签的插入也可以用 CRISPR 来帮助制备。


图 5:基因敲入小鼠制备示意图


基于 ES 的传统打靶

EPS 细胞助力节省 3 个月研究时间


虽然 TALEN 和 CRISPR 出现后,大大提高了基因编辑的能力,但 CRISPR 等技术也并非全能。随着敲入片段长度的增加,大于 1kb 的片段时,CRISPR 等技术效率逐渐下降,而传统 ES 打靶周期长,费用高。由北京大学和维通达共同合作研发获得的 EPS 细胞(cell 期刊号:169(2):243-257.e25.),具有超强的胚胎嵌合能力,一个 ES 细胞注入囊胚,就可以直接生出 ES 小鼠,越过嵌合鼠的步骤,节省三个月的时间,费用也大为节省。


图 6:基于 ES 的传统打靶小鼠制备示意图


(转化医学网360zhyx.com)

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