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Nature子刊:重磅!再也不怕DNA断裂了!新途径彻底解决CRISPR效率问题!

首页 » 《转》译 2018-08-02 转化医学网 赞(2)
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导读
CRISPR/Cas9技术问世以来,迅速成为生物科学领域的游戏规则改变者,7月31日,第一个成功将CRISPR/Cas9搜索功能用于实践的生物技术初创公司-MammothBiosciences赢得了2300万美元融资,更是让CRISPR/Cas9技术进入烈火油烹的境界。然而,该技术导致双链DNA的断裂




CRISPR/Cas9技术问世以来,迅速成为生物科学领域的游戏规则改变者,7月31日,第一个成功将CRISPR/Cas9搜索功能用于实践的生物技术初创公司-Mammoth Biosciences赢得了2300万美元融资,更是让CRISPR/Cas9技术进入烈火油烹的境界。然而,该技术导致双链DNA的断裂,一度成为阻碍CRISPR/Cas9技术发展的绊脚石。近日,著名学术期刊《Nature Genetics》发表的一篇文章表示科学家们发现了CRISPR/Cas9的第三条作用途径!而且这条途径中还存在可以修复断裂的DNA双链的关键蛋白!这对CRISPR/Cas9技术的进一步发展至关重要!



在谈新途径前,得先说说CRISPR/Cas9的“旧途径”是什么。简单点说,CRISPR/Cas9就是对DNA链进行切割和再修复,而所谓的“旧途径”就是指DNA再修复的两条常见途径。


在DNA链断裂后,CRISPR/Cas9有两个选择,要么直接添加碱基,破坏原有基因功能,通过沉默基因实现基因敲除,要么利用单链DNA模板,引入新的序列,对基因进行编辑。


这就是所谓的“非同源性末端接合(NHEJ)”与“同源介导修复(HDR)”。这两种途径存在很大的问题-一些DNA断裂后无法或难以及时修复,这也是日益喧嚣的“CRISPR/Cas9安全问题”的缘由之一。


那么,为什么NHEJ和HDR无法完全修复所有切割后的DNA链呢?这就要怪CRISPR/Cas9系统的“动态平衡”了。这就像一个可逆的化学方程,当基因编辑进行一段时间后,切割和修复过程就会自行达到平衡,这也是所谓的“饱和”问题。


而平衡后,尚有已断裂的DNA无人修复,从而导致一些基因功能的缺失。因此,要解决DNA断裂问题,就是要让这个平衡方程向修复方向最大程度倾斜,而加州大学伯克利分校的研究人员们发现的CRISPR/Cas9新途径-Fanconi贫血途径就有此功能。


FANCD2在Cas9切割的双链断裂位点富集


Fanconi贫血途径涉及21种不同的蛋白质,这些蛋白质的任何相关基因受损,都与一种罕见贫血症-Fanconi贫血症息息相关,这也是业内对该途径的普遍认识。然而,此次研究人员关注的是Fanconi贫血途径与CRISPR/Cas9的关系。


他们利用CRISPR干扰(CRISPRi)的技术对超过2000个基因进行切割,发现Fanconi贫血途径中的FANCD2蛋白可长期存在于CRISPR/Cas9产生的双链断裂位点上,调节FANCD2蛋白可以提高HDR频率。


也就是说,FANCD2蛋白可以打破CRISPR/Cas9系统存在的切割-修复平衡,使平衡向修复方向倾斜,提高基因编辑效率,降低不良反应。


Fanconi贫血途径基因敲除影响HDR效率


Fanconi贫血途径基因敲除不影响NHEJ效率


研究人员发现,Fanconi贫血途径并不作用于NHEJ,而是通过提高HDR效率将修复转向单链模板修复。Fanconi贫血途径与NHEJ是竞争关系,只要Fanconi贫血途径过度活跃,就会影响基因敲除的效率。另一方面,研究人员指出,FANCD2蛋白对HDR效率的影响力度超乎想象。


Fanconi贫血途径在体内普遍存在,一旦Fanconi贫血途径不够活跃,FANCD2蛋白功能受限,HDR就处于报废状态!也就是说,无法引入新的序列,无法基因进行编辑,CRISPR/Cas9系统只能崩溃!所以,如何把控Fanconi贫血途径的活性,是CRISPR/Cas9技术发展的重要课题!


Fanconi贫血途径活性影响基因敲除和基因编辑


而且,在CRISPR/Cas9系统里,FANCD2蛋白能且只能在Cas9切开的位点积聚,那么它就可以作为Cas9切口的有效标志,这就可以帮助科学家们快速准确地找出靶向和脱靶的切口。


研究人员指出,这项研究有助于加深我们对CRISPR/Cas9机制的进一步理解,有望提高基因编辑的效率,从而开发出更多有效的疗法,为更多疾病带来希望。

(转化医学网360zhyx.com)

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