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当我们使用CRISPR进行编辑的时候,应该遵循怎样的规则?

首页 » 《转》译 3天前 转化医学网 赞(2)
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导读
当使用CRISPR技术进行基因编辑时,DNA断裂通常会相当可靠地发生,但DNA修复却往往并非如此。近日,美国约翰·霍普金斯大学Geraldine Seydoux博士课题组通过实验验证了基因编辑过程中DNA高效修复的两个必要条件;线性供体DNA与约35个核苷酸的短片段长度。

该研究对应论文则发表于最新上线的PNAS,名为Precision Genome Editing Using Synthesis-Dependent Repair of Cas9-Induced DNA Breaks



Geraldine Seydoux博士及其同事将多种供体DNA的组合插入人类胚胎肾细胞中并使用供体荧光蛋白编码DNA对基因的插入进行了验证。


研究人员发现,在基因编辑的过程中,线性目的DNA片段的编辑效率相对更好,质粒的编辑效率高出2-5倍。 同时,文章的作者指出:“通常情况下,生物实验室可以通过PCR轻易地制备线性DNA。”


与此同时,研究人员还对不同长度同源片段的编辑效率进行了测定,他发现最佳长度的同源臂比那些科学家通常使用的要短得多。具体而言,长度为33至38bp的同源臂在最佳条件下能够产生10%至20%的成功编辑。相反,当科学家对长度为15和16bp的同源臂时进行测试时,插入的成功率则会下降一半。他们在人类基因组的三个不同位置重复了这些结果。


总体来看,该基因编辑实验的总体成功率为10%至50%,插入长度为57至993bp片段。在这些基因编辑试验中,较短的序列比较长的序列更易插入,例如,57,714和993bp片段同样时间内插入的成功率分别为45.4%,23.5%和17.9%。而当片段长度超过1000bp时,有效编辑则变得很难发生。


最后,研究小组还发现,当新序列位于离CRISPR切割位点两端30个核苷酸内时,编辑成功率就会出现峰值。 而当新序列位于切割位点30个核苷酸之外时,成功的编辑则变得难以发生。


除了常用的人类胚胎肾细胞之外,研究人员还在小鼠胚胎中验证了这些发现。


参考资料:Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks.doi: 10.1073/pnas.1711979114.


(转化医学网360zhyx.com)

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