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CRISPR应用指南:导入DNA、RNA还是蛋白质?

首页 » 产业 » 行业 2016-02-17 生物通 赞(2)
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导读
在基因组编辑的世界里,CRISPR/Cas9代表着王牌。它为研究人员带来了一种简单的方法,将核酸酶、转录调控因子或荧光蛋白送到基因组中的任何地址。这种方法已改变了疾病研究、基因调控、药物开发等。

  在基因组编辑的世界里,CRISPR/Cas9代表着王牌。它为研究人员带来了一种简单的方法,将核酸酶、转录调控因子或荧光蛋白送到基因组中的任何地址。这种方法已改变了疾病研究、基因调控、药物开发等。
  不过,研究人员首先需要将Cas9蛋白和向导RNA(gRNA)导入他们感兴趣的细胞。事实证明,他们有几种选择。
  各花入各眼
  在CRISPR/Cas9系统中,研究人员可以自由地选择转染DNA表达载体、mRNA和gRNA,或蛋白质。据赛默飞世尔转染部门的研发主管Xavier de Mollerat du Jeu介绍,这具体取决于研究人员需要多少蛋白,以及需要多长时间。
  他解释道,DNA表达载体往往在几天内产生高水平表达的蛋白质和RNA,但有延迟,因为基因必须被转录和翻译。对于Cas9 mRNA和gRNA,编辑更快发生,因为不需要转录,但在转录本降解之后会迅速下降。蛋白当然是最快的,因为不需要转录或翻译。与RNA一样,蛋白快速周转。
  Bio-Rad的全球产品经理Veronika Kortisova认为,对于Cas9而言,快速周转其实是件好事,因为与长期表达相比脱靶事件更少。“人们认为,当系统进去之后,它开展编辑并离开细胞,这样毒性较低。对于质粒,持续的蛋白表达有时会造成负面影响。”
  不过,Mirus Bio的研发负责人Laura Juckem认为,这也有缺点。最明显的是,蛋白和mRNA需要实验室额外的纯化工作,成本也比质粒DNA更高。当然,研究人员也能从一些供应商处购买现成的Cas9蛋白或mRNA,比如GE Healthcare Dharmacon、MilliporeSigma、美天旎、赛默飞世尔和NEB。
  转染选择多
  研究人员在导入核酸时通常有两种选择:转染试剂和电穿孔。转染试剂大多为脂质体、聚合物等。一些试剂是为特定类型的目标而设计的,比如Bio-Rad的siLentFect适用于siRNA,赛默飞的LipofectamineTM MessengerMAX适用于mRNA,而Promega的FuGENE专为DNA而优化。其他的转染试剂,如赛默飞的Lipofectamine 3000和Bio-Rad的TransFectin试剂,则支持更广泛的应用。
  电穿孔是在细胞膜上打了一个孔,如果分子能穿过这个缺口,则它就能进入细胞。“在导入CRISPR/Cas9工具时,Nucleofection非常高效,”Lonza的高级产品经理Andrea Toell谈道。Lonza的Nucleofection平台实现了各种细胞的电穿孔,包括难以转染的原代细胞。Toell还表示,Lonza提供了各种立即可用的操作方案,这样客户可立即启动他们的实验,而不需要优化条件。同样地,Bio-Rad的GenePulser Xcell和赛默飞的Neon系统也有类似的数据库。
  最近,市场上也出现了一些CRISPR专用的导入工具。比如,赛默飞的Lipofectamine CRISPRMAXTM就是一种新配方的Lipofectamine,专用于CRISPR-Cas9复合物的导入。它配合GeneArt Platinum Cas9核酸酶一起使用,可快速发挥作用,并降低脱靶剪切的风险。
  另一个选择是Clontech的Guide-itTM CRISPR/Cas9囊泡生产系统。据Hampe介绍,囊泡是由细胞系产生的一种布满糖蛋白的纳米囊泡。研究人员将他们的gRNA克隆到专门的表达载体,并将这种质粒以及表达病毒糖蛋白的质粒、Cas9和膜结合的红色荧光蛋白导入293T细胞。在系统被诱导之后,充满Cas9/gRNA的囊泡分泌到上清液中,随后可收集、浓缩并加入目标细胞中。
  研究新思路
  此外,还有一些场合,导入DNA、RNA和蛋白质都可行。一种是诱导多能干细胞(iPSC)的生成。目前有基于病毒和质粒的重编程试剂盒,是mRNA和自我复制的RNA系统,包括MilliporeSigma和Stemgent的产品。至于蛋白质,斯克里普斯研究所的丁盛及其同事早前将肽段与Yamanaka的4个重编程因子相融合,证明了蛋白质介导重编程的可行性。
  Bio-Rad的科研人员Frank Hsiung认为,导入哪种大分子在某种程度上取决于应用。“转染的目的是让新引入的元素能调控基因表达,”他说。“这完全取决于研究人员如何操控感兴趣的基因。”
  如果他们的目标是基因沉默,那么将siRNA导入细胞质可能就够了。如果快速发挥作用是关键,比如在特定时间点利用蛋白质来影响细胞行为,那么蛋白导入更有意义。
  有时,这个决定不是基于实验需要,而是基于细胞本身。有些细胞难以转染,至少对质粒DNA是如此,但这并不意味着其他分子也同样。“人们普遍认为,如果细胞难以转染,那么无论转染什么都很难,”de Mollerat du Jeu解释道。其实,有些细胞只是难以忍受DNA,但mRNA和蛋白都还好。这是因为DNA需要进入细胞核,而mRNA和蛋白不用。(入核需要细胞是活跃分裂的,而mRNA和蛋白只需要进入细胞质。)
  人们正在寻找转染中的圣杯,也就是毒性小、效率高并且通用的工具,Kortisova说。目前这样的技术并不存在,不过研究人员正在接近这个目标。与此同时,对CRISPR/Cas9系统感兴趣的研究人员也有了多样化的选择。
(转化医学网360zhyx.com)

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