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腾讯登录【盘点】单细胞测序研究这几年
| 导读 | 单细胞测序是指DNA研究中涉及测序单细胞微生物相对简单的基因组，更大更复杂的人类细胞基因组。最近几年，关于单细胞测序的报道日益增多。实际上单细胞测序是一个近年来的一个新兴研究领域。 |
单细胞测序是指DNA研究中涉及测序单细胞微生物相对简单的基因组，更大更复杂的人类细胞基因组。最近几年，关于单细胞测序的报道日益增多。实际上单细胞测序是一个近年来的一个新兴研究领域。
单细胞测序萌芽于2010年，2013年才真正发展起来，2014年，单细胞测序的应用被列为《自然—方法学》(Nature Methods)年度最重要的方法学进展，2015基因组学前沿研讨会将单细胞组学单独列为一个单元，可见单细胞测序在当前基因组学前沿研究中的热度。单细胞测序技术可谓是科技发展史上的一大创举。一个细胞里的DNA或RNA仅仅处在皮克（picograms）级的水平，这么少的量远远达不到现有测序仪的最低上样需求。因此科学家们必须先对单细胞内的微量核酸分子进行扩增，而且必须保证尽可能少地出现技术误差，以便开展后续的测序及其他研究。
本文中，小编对近年来单细胞测序的研究进展进行了盘点。
【1】新的单细胞测序全基因组扩增方法
北京大学生物动态光学成像中心黄岩谊课题组和谢晓亮课题组合作，在单细胞全基因组测序研究中获得取得重要进展，2015年9月4日在《美国科学院院刊》在线报道了一种用于单细胞测序的全基因组扩增新技术——乳液全基因组扩增，简称“eWGA”。该方法与已有的类似技术相比，大幅度提高了扩增的均匀性和准确性，可以同时检测出单细胞中的小片段拷贝数变异（CNV）和高精度的单核苷酸变异（SNV），该方法还具有基因组的高覆盖率并且能降低外源污染。eWGA成为目前综合指标最好的单细胞全基因组扩增技术。
单细胞研究是当前生命科学研究的重要方向之一。许多关键的生命活动，都和细胞间的个体差异密切相关；许多重要的生命科学和医学问题，所能倚赖的样品往往也是极少数细胞。在单细胞的基因组学研究中，由于DNA的含量极少，先需要通过全基因组的扩增技术将DNA进行扩增。在扩增过程中，由于扩增的不均匀性和酶的拷贝错误，扩增后的DNA和原始的DNA会有很大的区别，从而导致对单细胞DNA拷贝数和关键碱基突变信息的错误判定。
【2】谢晓亮：单细胞测序技术有望大幅增加试管婴儿成功率
今年2月底在美国佛罗里达召开的生物技术领域最有影响力的“全球基因组生物学与技术进展”（AGBT）大会上，美国科学院院士、北京大学长江讲座及千人计划教授、北京大学生物动态光学成像中心（BIOPIC）主任谢晓亮代表北大BIOPIC-北医三院生殖医学研究团队报告了一项最新的单细胞基因组扩增技术成果，首次实现了人类胚胎在植入女性子宫前的遗传诊断，该技术有望大幅提高辅助生殖（试管婴儿）成功率，并在其他产前诊断领域具有广泛的应用前景。
该团队由北京大学BIOPIC的谢晓亮实验室、汤富酬实验室及北京大学第三附属医院生殖医学中心乔杰实验室组成。 他们将谢晓亮哈佛大学实验室去年底发表在《科学》上的MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles) 技术应用于临床，从而确立了基于单细胞基因组高通量测序的植入前基因诊断新方法。 据外媒报道，该报告引起与会同行的高度关注并获得了多家媒体报道，冷泉港实验室的Gholson Lyon 评价说谢晓亮教授的报告是“本届大会上最有趣的学术报告，从技术的角度讲，非常酷”。
【3】新型单细胞外显子组测序法
最近，美国MD安德森癌症研究中心和德克萨斯大学休斯敦健康科学中心的研究人员，开发出一种新型单细胞外显子组测序方法称为SNES。与目前大多数单细胞测序方法形成对比，SNES利用细胞核而不是细胞进行分析，从而将会在生物学许多不同领域具有广泛的应用。相关研究结果发表在2015年3月25日的国际著名学术期刊《Genome Biology》。
单细胞测序方法可让我们深入阐述罕见细胞亚群和复杂细胞混合物的基因组，但目前存在的广泛技术错误和不良物理覆盖数据带来了一定的挑战。虽然单细胞RNA测序方法的开发已经取得了一定进展，但全基因组DNA测序方法的开发，已被证明更具挑战性，因为单细胞含有每个mRNA分子的数千份拷贝，但只有每个染色体的两个拷贝。因此，每个细胞只能提供两个模板DNA用于全基因组扩增反应（WGA），所有后续的分子会继承第一轮扩增中发生的错误。
在这项研究中，该研究小组开发了一种新型单细胞外显子组测序方法，称为SNES，这种方法可以实现来自单个哺乳动物细胞的外显子组数据的高覆盖率（96%）。从这些数据我们发现，我们可在碱基对的分辨率上，准确地检测SNVs和缺失。
【4】当宏基因组遇上单细胞测序
日前，科学家们通过宏基因组测序和单细胞测序鉴定了一类新细菌。
16S rRNA基因序列的保守性和普遍性，使其成为了微生物检测和分类鉴定的强有力工具。这种方法为科学家们揭示了微生物群体的高度复杂性，但它还是有所遗漏。美国能源部联合基因组研究所上周的一次会议上，研究者人员向人们展示了在四个温泉样本（北美和亚洲）中发现的一类新细菌Candidatus Kryptonia。这项研究共测序了22个Kryptonia基因组。
基因组分析显示，Kryptonia属于拟杆菌门。拟杆菌门的成员一般生存在肠道或海洋中，而Kryptonia是其中首个极端嗜热菌。研究人员指出，Kryptonia可能是通过水平基因转移从古生菌获得这种能力的。
16s rRNA检测无法发现这种细菌，这是因为在通用引物的结合处发生了删除事件。Nikos Kyrpides领导团队通过宏基因组测序和单细胞测序证实了这种细菌的存在，并将其命名为Kryptonia。
【5】北大谢晓亮、黄岩谊教授PNAS开发单细胞测序新技术
来自北京大学的研究人员报告称，他们开发出了一种基于乳液的扩增方法来抑制扩增偏移检测单细胞拷贝数变异（CNV），同时以高精确度检测单核苷酸变异(SNV)。这一方法能够与各种扩增实验方案包括广泛使用的多重置换扩增(MDA)相兼容。这一重要的成果发布在9月4日的《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。
北京大学的谢晓亮（X. Sunney Xie) 教授及黄岩谊（Yanyi Huang）教授是这篇论文的共同通讯作者。谢晓亮教授是单分子生物物理化学和相干拉曼散射显微成像的开拓者之一，其研究组在离体实验及活细胞内生物系统在单分子水平的动力学研究方面取得了不少重要的成果，尤其是单分子荧光显微技术，比如相干拉曼显微成像技术(CARS、SRS)等方面成果斐然。近年来，他又在单细胞测序技术上取得突破，发表了不少重要成果。黄岩谊教授课题组主要致力于发展应用于集成生物学研究的新技术。
【6】《转》访陈重建博士：乘风破浪，单细胞测序再创新突破
2015年4月27日，Nature Methods杂志上发布了一项引人注目的测序技术，基因组与转录组平行测序(Genome and Transcriptome Sequencing， G&T Seq)。该技术实现了对单个细胞内的DNA和RNA平行测序，能够展现单个细胞的基因变异与基因功能之间的关系。作为国内单细胞测序技术整体解决方案的领导者，安诺基因也一直在此方向投入研发。谈及在单细胞测序技术领域的不断建树与突破，总裁陈重建博士表示，单细胞测序技术已经成为科研中的核心应用手段，而全新的单细胞基因组与转录组平行测序技术(G&T-Seq)，将有助于生命科学研究领域取得更多的原创性发现。
单细胞基因组和单细胞转录组高通量测序技术，已经成为单细胞研究重要的工具，但是主要挑战是在对同一细胞进行基因组DNA和RNA的平行研究上。单细胞基因组与转录组平行测序(G&T-Seq)，这一整合技术的重要意义在于可以分析单细胞基因型和表现型之间的关系，深刻揭示一个细胞内的DNA信息指导细胞状态的调控机制。就如同我们一直希望看到的那样，真正了解细胞内部是如何进行精确的表达调控，而不是通过传统方法在群体细胞样本中得到的所谓DNA与RNA大致的对应关系。这项全新的技术真正实现了在一个时空内遗传物质的综合研究，揭示先前无法探索到的细胞内分子生物学调控机制，这甚至可能改变人们最初建立的认知范畴，势必会带动分子生物学领域的飞速发展。
【7】Nat Methods：单细胞测序新技术
来自瑞典Ludwig癌症研究所及Karolinska研究所的研究人员，在近日的Nature Methods杂志上报告了一项获得重大改良的新技术，可以利用它来分析单细胞中的基因表达——这一性能与从基础研究到未来癌症诊断的一切事物均存在关联。
资深作者Rickard Sandberg 说：“在肿瘤和健康组织中有一些细胞的数量稀少，除了单细胞方法没有任何其他的技术能够对它们进行分析。这种方法使得我们能够鉴别各种各样组织中稀少且重要的细胞亚群。我们还能够利用它以从所未有的精确性，梳理分析随着胚胎发育为生物体或是肿瘤获得转移性，细胞从一种状态转换至另一种状态独特基因组的表达情况。”
传统的方法依赖于一次性总体分析数百万个细胞的基因表达，往往会掩盖特异组织中某些特化细胞具有生物学意义的基因表达差异。单细胞分析基因表达克服了这一局限。
为了开发出这一命名为Smart-seq2的新技术，Sandberg研究小组开展了450多次试验来改进他们的初始方法。新程序将捕获RNA分子的数量提高了3-4倍，相比当前的技术每个细胞转换的基因数多出了2000多个。它还可以捕获更加完整的基因序列，在这类研究中这是一个极大的挑战，当前的方法通常只能捕获到表达基因的部分序列。这将使得研究人员能够更细致地分析，不同人群相同基因之间的细微差异——单核苷酸多态（SNPs）是如何造成生物学和疾病中的差异的。
【8】单细胞测序技术可应用于癌症无创诊断
2013年12月10日著名学术期刊PNAS在线发表了北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心谢晓亮、白凡课题组与北大肿瘤医院王洁团队合作的研究结果。在题为“Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients”的研究论文中，研究人员通过单细胞基因测序手段首次报道了对于癌症病人单个外周血循环肿瘤细胞的全基因组、外显子组测序结果，此项研究对于揭示癌症转移的分子机制具有重要意义，同时还为无创癌症诊断提供了一种新的技术手段。
肿瘤的转移是导致癌症病人死亡的主要原因。早在1896年，澳大利亚籍医生Ashworth首次在癌症病人血液样品中观察到循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell， CTC）的存在。在肿瘤转移过程中，癌细胞从原发肿瘤脱落，进入血液或淋巴循环系统，其中一些具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，成为循环肿瘤细胞，并进一步发展为远端器官转移肿瘤。循环肿瘤细胞是肿瘤发生远处转移的必经步骤，因此在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有发生肿瘤转移的可能。
近些年来，对于癌症病人血液中CTCs的计数已逐渐用于癌症治疗的疗效评估。如果能对CTCs进行基因组分析将有助于我们更好地了解肿瘤转移的生物学机制；同时，作为一种非侵袭性的检测手段，CTCs的基因组分析还可以为疗效评价、预后判断以及个体化治疗提供及时可靠的依据。然而，由于循环肿瘤细胞在病人外周血中存在的数量极其稀少，对其进行基因组测序具有较大难度。
【9】Science：科学家发布单细胞测序重大成果
利用单细胞测序技术，瑞典卡罗林斯卡学院（Karolinska Institute）的科学家们生成了有关皮质细胞类型以及细胞内活化基因的详细图谱（延伸阅读：Science发布新型单细胞基因表达检测技术 ）。这项发表在Science杂志上的研究，是第一次应用这种方法如此大规模地分析这样复杂的组织。研究小组一个一个地检测了3000多个细胞，并发现了一些迄今未知的细胞类型。
医学生物化学和生物物理学系资深研究员Sten Linnarsson说：“如果你将大脑比作是一份水果沙拉，你可以说从前的研究就像是用搅拌机来压榨水果，看看从大脑的不同部分你能获得什么颜色的果汁。而近年来，我们开发出了更加灵敏的分析方法使得我们能够看到哪些基因在单个细胞中活化。这就像是取出水果沙拉片，逐个地检测它们，然后将它们分成数堆，看包含多少不同的水果种类，它们由什么构成以及如何相互关联。”
大约在200年前人们认识到所有的活体生物都是由细胞构成。自从19世纪德国的一组科学家们获得这一研究发现以来，我们还知道了机体特定组织的特性是由组成细胞所决定，而后者则是由细胞DNA中活化的基因所决定。然而，直到现在对于这一切是如何详细发生的，尤其是对于机体最复杂的器官大脑仍知之甚少。
【10】PNAS：单细胞测序绘制大脑的细胞图谱
斯坦福大学的著名学者Stephen Quake及其同事本周在《美国科学院院刊》（PNAS）上发表文章，介绍了人类脑细胞的单细胞转录组测序研究成果。
研究小组对近500个成人或胎儿脑细胞进行了单细胞RNA测序。利用这种方法，他们能够鉴定出大脑中所有主要的细胞类型，并确定神经元的亚型。他们还观察了神经元从早期发育到后期分化阶段的变化。
“这些结果为构建人类大脑的细胞图谱奠定了基础，”作者在文中写道。“这种图谱将有助于我们确定神经元、胶质细胞和血管细胞的特定标志物，并将其与其他信息相关联，以便完全阐明人类大脑的细胞复杂性。”
人类大脑是极其复杂的。它含有许多种类的细胞，它们的基因表达模式存在差异。因标志物相对较少，传统的细胞分类方法存在限制，因此只能提供特定细胞类型的有限分子鉴定。
在这项研究中，研究人员使用了健康的神经元。它们是在癫痫的外科手术治疗过程中从人体中取得的。除了从8名成人中获得的样本，研究人员也研究了4个胎儿大脑样本中的细胞。他们总共对466个细胞进行单细胞RNA测序，以捕获成人和胎儿大脑中的细胞复杂性。（转化医学网360zhyx.com）
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