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【干货】甲基化PCR检测、优化建议及优质分子酶的应用案例

首页 » 产业 » 企业 2024-05-23 转化医学网赞(10)

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人体中的单个基因（DNA 生物标志物）可能会在癌症存在时发生改变。能够在基因水平上识别这些修饰，为医生提供一种工具来帮助诊断癌症、评估癌症复发（转移）的风险，并预测个体患者对癌症治疗的可能反应。

导致癌症发生的基因突变之一是DNA甲基化，这是评估癌症的重要工具，甲基化DNA生物标志物几乎存在于所有恶性肿瘤中。

甲基化PCR

甲基化PCR（Methylation-Specific PCR, MSP）是研究DNA甲基化最广泛使用的技术。这种简便、快速且特异的方法可用于检测CpG岛（DNA发生甲基化的位置）内几乎任何CpG位点组的DNA甲基化状态，且无需甲基化敏感的限制性酶。

此外，MSP仅需要少量DNA，并且可以高度灵敏地检测基因座特异性DNA甲基化（特定基因座中甲基化等位基因的检测水平 < 0.1%）。

甲基化PCR与普通PCR最大的不同在于它使用两个单独的PCR引物进行两个单独的PCR反应。

甲基化PCR的基本原理是亚硫酸氢盐转化的DNA的特异性PCR扩增。用NaHSO₃处理基因组DNA将样本中未甲基化的胞嘧啶（unmethylated cytosine）转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶(methylated cytosine)可以抵抗这种修饰并保持不变。然后，使用甲基化与未甲基化DNA特异性引物对亚硫酸氢盐转化的DNA进行PCR扩增，其中一组（引物 M）特异性结合甲基化序列，另一组（引物 U）仅与非甲基化序列结合(图1）。

图1. 甲基化PCR过程

在PCR扩增的特定退火温度下，两套引物组与模板结合的Tm值不同，因此，如果能用引物M来扩增片段，则检测到的位点是甲基化的；如果用引物U扩增该片段，则检测到的位点不存在甲基化。最后，通过凝胶电泳成像确定目标DNA序列的甲基化状态（图2）。值得注意的是，DNA带大小取决于启动子中存在的 CpG 数量。使用实时定量MSP可以高度准确地区分阳性和阴性结果。

图2. 甲基化PCR结果解读

在此基础上，MSP又衍生出多重甲基化检测、巢式甲基化检测、甲基化HRM检测、COBRA检测（限制性内切酶法）等（图3）。

图3. 不同甲基化PCR对比

甲基化PCR的优点：

检测一个或多个基因靶标内CpG岛的甲基化状态

高灵敏度检测位点特异性DNA甲基化

适用于多种样品，如体液、石蜡包埋样品

简单、快速且经济高效的技术

甲基化DNA PCR的应用前景：

1.癌症早期诊断和预后评估

甲基化标记可以作为癌症早期检测的生物标志物。例如，特定基因的甲基化状态在某些癌症（如乳腺癌、结直肠癌和肺癌）中发生显著变化，通过检测这些变化可以实现早期诊断。

不同癌症亚型具有不同的甲基化模式，通过分析这些模式可以预测疾病进展和患者预后，从而指导个性化治疗方案。

2. 药物敏感性预测和耐药性监测

一些基因的甲基化状态可以影响药物的代谢和效力。通过检测这些基因的甲基化状态，可以预测患者对特定药物的敏感性，从而优化治疗策略。

甲基化状态的变化可能与药物耐药性相关，通过监测这些变化可以及时调整治疗方案。

3. 遗传和表观遗传研究

甲基化是基因表达调控的重要机制之一，研究基因甲基化状态可以揭示其在基因表达和疾病发生中的作用。通过甲基化分析可以研究环境因素对基因表达的影响及其在代际间的遗传效应。

甲基化PCR步骤及优化建议

完整的甲基化PCR包括DNA提取、亚硫酸氢盐转化、MS-PCR引物设计、修饰后的DNA纯化、PCR扩增及检测。

优化建议：

1. 引物设计的质量是扩增成败的关键MSP的引物设计与普通的PCR引物设计不同，MSP的引物设计原理是：模板DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点 5'-端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点 5'-端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C-U。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基化引物，进行PCR扩增。以下是MS-PCR引物设计的几条基本原则：

靶向基因启动子区域的CpG岛

CpG对DNA甲基化高度敏感。引物应位于基因CpG岛的侧翼，但避开边界

CpG边界会影响扩增效率，因此应避免使用

引物应位于转录起始位点(TSS) 附近。研究表明，TSS的1000bp上游和500bp下游区域是引物设计的良好选择

引物应有效区分甲基化和非甲基化序列

MS-PCR引物应比普通 PCR引物长。特别是包含富含AT的对应物的非甲基化引物。甲基化引物应较短，而非甲基化引物应较长

非甲基化引物的理想长度应在20-30个核苷酸之间

每个引物在3'端应至少包含一个富含CpG的互补区域，但是，两个引物应具有相同数量的CpG

引物组的设计使得PCR产物不应超过300bp

两个引物之间的Tm不应超过 5°C

还需要注意的是，引物还应含有足够数量的非 CpG“C”核苷酸，以有效扩增亚硫酸氢盐转化的 DNA。

初设计MSP者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到相应的MSP引物，可用在线MethPrimer软件在线设计引物（ http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html）。根据软件提示可以找到所需要的MSP引物。

MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其（C+G）含量相对较高，MSP扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如 Primer5.0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率小于30%的引物要进行优化，方法是在核心启动子区域前后反复调整甲基化正向引物打增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。

2. DNA的NaHSO3修饰

NaHSO3修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败。

具体建议如下：
① NaHSO3：浓度最好控制在3.0 ~ 3.9mol/L，其pH值必须用NaOH精确调整至5.0
② 修饰时间：应掌握在10~16h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底
③ 反应温度：应控制在50~55 ℃

④ DNA模板量：应控制在2μg为宜

3. MSP反应体系

MSP的反应体系的成分与普通PCR一样，反应体系的优化也与普通PCR类似，最大的区别是DNA模板不同。

① 模板纯度：经过修饰后的模板为单链状态，因此MSP的DNA模板在提取后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260/A280在 1.8~2.0之间

② 模板含量：含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加得太多而导致DNA处理不完全致使MSP扩增失败；DNA模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性

③ Mg浓度：2.0~2.5 mmol/L 为宜

④ PCR的缓冲液及Taq酶：优化好的缓冲液和Robust的Taq酶对结果的灵敏度和重复性也很重要

4. 凝胶电泳分析

MSP 扩增结果出现3种情况：

① 产物电泳为阴性；② 产物电泳出现多条非特异性条带（含目的基因条带）；③ 产物电泳为阳性（仅目的基因条带）。

出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带

方法如下：PCR反应中，Tm的高低与（C+G）含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR偏性。通过以上优化和注意事项，可以提高MSP的扩增效率和准确性，实现对基因甲基化状态的准确检测。

迈迪安分子酶/预混液在甲基化PCR的优异应用

可风干血液直扩qPCR(MDX092)甲基化检测

1. 针对亚硫酸氢盐处理的样本

经过对提从血液中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理后，对一组不同程度（1%、2%、5%和10%）的人体甲基化DNA样本进行检测，使用迈迪安可风干血液直扩qPCR预混液MDX092进行qPCR检测以对其区分不同甲基化水平能力的灵敏度进行评估。

*brcal qPCR检测是专门针对brcal启动子区域甲基化的亚硫酸氢盐转换序列的扩增。

使用MDX092分别为2000,200和20个拷贝的人体基因组样本进行brcal qPCR扩增, 扩增曲线可以清楚地区分1-10%甲基化(图4)。

与对比试剂Q相比，MDX092的可检测模板浓度低5个数量级(图5)。

图4. brca1的甲基化水平区分。MDX092可以明确区分1%，2%，5%和10%甲基化，并且可以检测低至1拷贝 (e.g. 从20个拷贝中模板检测出5%甲基化DNA)。

图5.与专用甲基化检测的预混液Q进行性能比较。

2. 针对MSRE处理样本处理的样本

使用甲基化依赖酶(仅切割甲基化DNA)或甲基化敏感酶(仅切割未甲基化的DNA)也可作为亚硫酸氢盐处理的替代方法以确定甲基化水平。

从血液中提取的DNA样本在简单的经过消化酶处理后经过热失活步骤，甲基化使用迈迪安可风干血液直扩qPCR预混液MDX092进行扩增,以区分与亚硫酸氢盐处理相同的低水平甲基化靶标brca1(图6)。

图6.MDX092-MSRE检测。人体gDNA经过Lpn I和Ssi I (Aci I)限制消化处理后在80℃热灭活20 min，取5 μl直接加入20 μl qPCR反应进行brcal qPCR检测。

Taq抗体热启动聚合酶(MDX008)甲基化检测

本研究针对HPV衍生的癌蛋白E7对宿主DNA甲基化的影响1。实验里从E7转染的HEK293细胞中选择了四个靶标基因(C1QBP、BCAP31、CDKN2A和PTMS)，以评估E7转染的HEK293、未转染的HEK293中相关基因启动子的甲基化情况。使用迈迪安抗体修饰的Taq MDX008对被甲基化的靶标基因进行扩增，然后扩增产物通过电泳分析（图7），与空质粒转染的HEK293和阴性对照相比，E7转染HEK293细胞中四个靶标基因甲基化化DNA条带显著增加。通过该E7对靶标基因甲基化程度的研究，显示了迈迪安抗体热启动Taq HS聚合酶MDX008对甲基化DNA的高效特异性的扩增。