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卡脖子!mRNA疫苗质量控制中不可缺少的关键原料!

首页 » 产业 » 企业 2022-05-10 转化医学网 赞(20)
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导读
2021年2月24日,《MIT Technology Review》发布了“全球十大突破性技术”名单,其中榜首即是mRNA疫苗。


全球十大突破性技术榜首--mRNA疫苗

2021年2月24日,《MIT Technology Review》发布了全球十大突破性技术”名单,其中榜首即是mRNA疫苗。从2019年12月新冠爆发到2022年4月1号,全球新冠确诊已超4.8亿。新冠病毒的蔓延促进了mRNA疫苗的发展。mRNA疫苗在新冠疫苗开发方面的成功,也促进了其在各种传染病与肿瘤等治疗方面广阔的应用前景。

mRNA疫苗的生产流程包括序列设计、mRNA体外转录、体外修饰(加帽、加尾)、脂质体包被等过程。2020年发布的《预防用新型冠状病毒mRNA疫苗药学研究技术指导原则》中对mRNA的质量提出了一系列的要求,加帽率和加尾长度是其中最关键的2个指标。5’cap (5’帽)结构是翻译起始所必须的结构,为核糖体识别mRNA提供信号,并协助核糖体与mRNA结合使翻译从起始密码子开始。3’poly(A)(3’尾)可以控制mRNA的稳定性,以防降解,所以在mRNA合成修饰过程中,需要对5’加帽效率和3’poly(A)尾的分布进行监控。

图.1 mRNA的结构可以分为5个部分,包含5cap,5UTR,ORF,3UTR和3’polyA。

疫苗mRNA因为长度较大,为几千个核苷酸,而无法直接进行检测,因此需要将5’ cap和3’ poly(A)端酶切成短片段,酶切之后5’ cap和3’ poly(A)均可以通过纳米磁珠进行高通量、快速分离,这种纳米磁珠通常粒径在1-3μm之间

5’cap端检测流程
测定加帽效率主要是通过将5’cap端与生物素标记的引物退火,然后将5’cap端酶切成小片段,通过SA磁珠捕获出biotin标记部分,然后将5’cap从磁珠表面洗脱通过毛细管凝胶电泳或质谱法进行检测(图2)。
图2. mRNA 5’帽子序列酶切,磁珠分离纯化流程
3 PolyA尾分布检测流程

3’ PolyA尾的检测方法与5’加帽效率的检测方法类似,需要通过酶切的方式获得3’端的Poly A尾短链,然后利用Oligo dT磁珠分离纯化再分别进行毛细管电泳或质谱准确分析其长度分布(图3)。

图3. 3’ Poly(A)尾分布的检测流程

在mRNA的5’端加帽效率和3’加尾分布的检测过程中,都需要磁珠进行mRNA片段的富集。磁珠的性能影响到整个检测数据的准确性和可靠性该过程中的磁珠一般需要如下的特征:

a) 非特异性吸附低;

b) 灵敏度高,磁珠表面具有丰富的结合位点;

c) RNA易洗脱,磁珠表面需要特殊的封闭;

d) 耐受有机溶剂,部分操作会使用95%乙醇,对磁珠的溶剂耐受性有很大的要求。

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