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疾病诊断之甲基化qPCR检测

首页 » 产业 » 企业 2021-09-22 近岸蛋白 赞(13)
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导读
我国对DNA甲基化检测最近注重起来了。2021年8月25号,北京市医疗保障局发布京医保发〔2021〕23号文件,文件中规范调整了北京市公立医疗机构共284项医疗服务价格项目,以进一步完善医疗服务价格政策。
通常意义上的DNA甲基化是指基因组DNA序列上CpG岛的二核苷酸5’端胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶(5’methylcytosine, 缩写5mC)。在哺乳动物细胞中,甲基化主要发生在CpG岛,片段长度为500-1000bp,约56%的编码基因含有此结构。CpG岛和许多生命表征如X染色体失活、细胞发育以及疾病形成等有紧密的联系,这也使得对于CpG岛甲基化的探索成为表观遗传学研究的重点。特别是在疾病诊断过程中,CpG岛甲基化程度的检测,很大程度上的帮助患者预后。

图1.CpG岛胞嘧啶甲基化

我国对DNA甲基化检测最近注重起来了。2021年8月25号,北京市医疗保障局发布京医保发〔2021〕23号文件,文件中规范调整了北京市公立医疗机构共284项医疗服务价格项目,以进一步完善医疗服务价格政策。其中基因甲基化检测被作为实验室诊断项目纳入甲类医保服务项目及甲类工伤保险项目内,即全额纳入报销范围。与此同时,在广西和福建等地也开展了相关甲基化检测项目。

图2.北京市部分医疗服务价格项目规范调整信息

甲基化检测市场预估虽然较为可观,但是从目前的行状态来看,甲基化检测整体产业链并没有很大的发展,这需要产业从业人员在国家政策的指导下向前推动。行业发展滞缓的部分原因:检测服务机构和试剂厂商数量不足,无法满足市场需要。NMPA批准甲基化检测试剂厂商如鹍远、透景、厦门艾德、广州康立明等,不足10家公司;甲基化检测种类较少,目前NMPA批准的甲基化检测种类仅涉及septin9、SHOX2、RASSF1A、RNF180、SDC2、MGMT、BMP3、NDRG4,主要是荧光PCR检测;医疗系统甲基化检测项目没有全国性铺开等。

01 CpG岛(CpG island)
CpG岛是基因组上一段CpG二核苷酸高度聚集的DNA回文序列。在哺乳动物细胞中,CpG岛常常富集于转录调控区周围,如启动子和第一外显子上。大小约为100-1000bp,且常常是处于非甲基化的状态。

CpG岛与甲基化。CpG岛一般处于管家基因和活跃表达基因启动子周围,而在不活跃表达的基因附近CpG岛常常处于甲基化。一旦CpG岛的胞嘧啶发生甲基化,就会抑制转录因子的结合,进而抑制基因的表达。与此同时,甲基化的CpG岛还会吸引一些蛋白复合物,致使组蛋白乙酰化以改变染色质结构,促使转录沉默。另外,CpG岛中甲基化胞嘧啶(C)可以通过脱酰胺作用转化为胸苷(T),即发生CpG到TpG的转变,这种转变体内错配修复酶无法修复,造成体细胞突变。

图3.CpG岛甲基化与基因表达的关系

02 CpG岛甲基化检测
CpG岛甲基化与许多疾病有密切的联系,因此对CpG岛甲基化程度的检测可以很好的患者预后。CpG岛甲基化检测分为三大类:一类是基因组甲基化水平分析,如高效液相色谱HPLC、高效毛细管电泳HPCE法;另外一类是候选基因甲基化分析,如重亚硫酸盐测序法、甲基化荧光PCR法、甲基化特异性PCR(MS-PCR)、焦磷酸测序等。还有一类为基因组范围的DNA甲基化模式(Methylation pattern)与甲基化谱(Methylation Profiling)分析,如RLGS、MCA等。目前,NMPA批准的甲基化检测试剂盒厂商均为荧光PCR法。荧光PCR法高效,迅速,具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点。

CpG岛甲基化荧光PCR检测法要结合重亚硫酸盐处理,其原理为:首先用重亚硫酸盐处理待测DNA片段,将非甲基化CpG岛转换为甲基化的形式。然后设计的探针与待测位点结合,随着PCR的扩增进行,探针被切割释放荧光基团发出荧光。通过测定每个扩增循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化程度。通过解读报告,预判患者情况。

图4.CpG岛甲基化荧光PCR检测法示意图

近岸蛋白(Novoprotein)立足于表观遗传疾病诊断研究,开发出一款可以高效检测CpG岛甲基化的荧光PCR试剂盒,只需要在试剂里面添加引物探针即可快速检测靶基因。

优秀的扩增性能,能够高效扩增靶基因:
图5. Novoprotein试剂对靶位点的扩增

较强的普适性,即可单重扩增,也可双重扩增:
图6.Novoprotein试剂双重扩增靶位点无压力

试剂稳定性强,37℃放置14天,扩增性能不变:
图7.Novoprotein试剂放置14天后仍可扩增靶位点

试剂抗逆性强,反复冻融破坏20次,扩增性能不变:
图8.Novoprotein试剂反复冻融20次扩增性能不变

03 CpG岛与疾病
CpG岛大部分存在于转录活化区域,如启动子和第一外显子周围,与基因的表达有密切的关系。若体细胞CpG岛甲基化状态发生改变,那么原有的基因的表达模式发变化,必定影响生命表征。如常见的癌变,正常体细胞抑癌基因启动子区CpG 岛甲基化程度较低,抑癌基因正常表达,抑制体细胞癌变。一旦CpG岛高度甲基化,抑癌基因发生沉默,无法正常表达,体细胞极易癌变。再如智力迟钝症状,在胚胎发育过程中,因为某些特定基因在配子中逃避去甲基化,导致这些基因高度甲基化,无法表达,影响胚胎发育。因此,基因组甲基化程度有着严格的标准,一旦出现甲基化异样,那么常常伴随非正常表征的出现。

目前来看,我国甲基化的检测的项目比较少,仅涉及肠癌、肺癌、胶质瘤几种疾病。

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