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【精华】分子POCT诊断试剂研发面临的挑战及解决方案: LAMP vs. qPCR

首页 » 产业 » 行业 2021-06-22 转化医学网 赞(9)
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导读
POCT 即时检测 (Point-of-Care Testing) ,是在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。近年来,POCT在诊断市场上迅速获得青睐,尤其是在传染性疾病诊断上。2020年初的新冠疫情,因其大规模基层检测需求,更是加速了传染类疾病POCT的快速发展,其中分子POCT崭露头角,迅速登上诊断舞台。


2020年7月,国家国务院常务会议上,李克强总理更是第三次点名加快分子POCT研发,再次强调了要加强核酸检测能力建设,加快时间短、灵敏度高、操作简便的产品研发上市,鼓励尽快研发出无需实验室环境、检测时间更短、手段更便捷、准确率更高、更安全的核酸检测迭代技术。


qPCR目前是分子检测的黄金标准,但是该技术受流程繁琐、操作复杂、需集中送检等限制,耗时相对较长,无法实现4小时内出具报告。且需要在特定的PCR实验室中进行操作,操作人员也需持有PCR上岗证,目前部分医疗机构并不具备核酸检测能力,县级医院建设PCR实验室也存在诸多困难和限制。


分子诊断POCT技术集成了分子诊断技术和POCT技术,它与传统的qPCR都具有快速、高灵敏度和特异性等共同优势,同时又突破了现有检测技术对人员/场所的限制,有效缩短了检测用时,提升了便捷程度。面对突发重大疫情,POCT核酸检测可应用于更多场景,实现患者的现场及时检测。


近十几年来,等温聚合酶链反应,如环介导等温扩增 (LAMP)已经成为一种适用于分子POCT平台的理想方法。迈迪安生物科技公司(Meridian Life Science)早在 2010 年首次利用LAMP技术开发出了第一个用于诊断艰难梭菌的商业化诊断试剂及设备(Alethia®)。从那时起,我们在Alethia®平台上开发并商业化了一系列用于传染病诊断的检测试剂,比如 A 组链球菌、B 组链球菌、一型和二型单纯疱疹病毒、百日咳,肺炎支原体,衣原体、淋病和疟疾等。


迈迪安作为全球诊断厂商首选的上游原料试剂生产商,现提供一系列常温稳定的干燥型分子试剂,包括可冻干LAMP/RT-LAMP及qPCR/RT-qPCR试剂,可为分子POCT平台提供完整的解决方案。我们的Alethia® 的系类产品全部采用冻干试剂。


本文里将重点探讨在使用qPCR和LAMP 技术开发POCT诊断中面临的挑战,以及迈迪安生物提供的解决方案。


LAMP vs. qPCR


1.成本

LAMP 可以在等温条件下实现扩增,不需要进行像qPCR反应一样经过三个温度的循环,减少了qPCR 技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求,因此LAMP仪器通常体积小、质量轻、便携带、制造成本低。


但是,就单重检测来说,LAMP技术一般需要3对引物,引物设计难度比qPCR更高,试剂成本相对也高于qPCR。


2.扩增速度

由于LAMP只要一个温度(65度左右)反应,相对于qPCR的三个温度的循环,LAMP扩增不需要反复的升温降温过程,所以基于LAMP的扩增速度快于qPCR的扩增速度。LAMP一般可在15-60分钟扩增10^9~10^10倍,而qPCR的扩增速度往往取决于扩增仪器加热和冷却的速率。



由于LAMP可以短时间内获得大量类似花椰菜结构的DNA产物和白色焦磷酸状沉淀,因此可以实现基于浊度的可视化检测,或在反应体系中加荧光染料(如SYBR Green)通过荧光变化检测 (如下图)。从这个角度上讲,LAMP尤其适用于定性的POCT。



LAMP反应扩增产物


LAMP反应中加入SYBR Green的显色反应。-: 阴性;+:阳性


但是,LAMP扩增的快速也导致了终产物的浓度高,容易出现假阳性扩增,交叉污染的概率也大大提高。LAMP扩增因为没有PCR的温区切换过程,因此获得的扩增产物是片段大小不一的序列,不利于后续的定量。


3.扩增特异性

LAMP 技术分别使用一对外部引物和一对内部引物,可以识别目的序列上6个不同的区域,对目标序列具有高度的选择性,减少了非靶标序列的影响,因此扩增的特异性非常高。



基于探针法的qPCR,通过引物特异性的设计,也可以达到高特异性的扩增。因此从这个角度上说,并不能简单的比较两个技术扩增的特异性


4.灵敏度

之前有很多案例显示qPCR检测的灵敏度略高于LAMP, 但是在SARS-CoV-2检测的对比中显示qPCR和LAMP具有相同的灵敏度1,2。 


5.抗抑性

LAMP技术对常见的PCR抑制物耐受性更强,因此,对于某些病原体可直接利用简单处理的样本作为模板,省略繁琐的DNA/RNA 提取步骤,因此非常适合用于POCT平台,更便于现场免核酸提取的诊断。 


6.多重检测

LAMP对单一靶标的扩增需要4-6个引物,qPCR需要2个引物,因此LAMP多重检测的难度大大高于qPCR。基于探针法的qPCR可实现探测荧光通道的多样性,因此是也适用于高通量检测。 


7.操作性

qPCR需要精密的扩增设备,对操作人员的熟练度和专业水平比较高,而LAMP设备简单,对操作人员技术要求相对较低,因此操作性上更高,更利于在基层检测和口岸检疫场所推广。


LAMP 与PCR检测对比总结如下:


综上所述, LAMP 技术因其反应快速、特异高、设备简单易操作、结果易于鉴定等优点,已经应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领域,并且还将广泛应用于临床传染病诊断、环境监测、食源安全等领域,是POCT检测的理想选择。


Meridian迈迪安提供一系列常温稳定的干燥型分子试剂,包括可冻干LAMP/RT-LAMP及qPCR/RT-qPCR试剂,可为分子POCT平台提供完整的解决方案。


为了更深入探讨这个话题,更好地为各位同仁提供分子POCT研发的解决方案,我们将于2021年6月24日(周四)晚8-9:30pm线上直播,欢迎您的参与与交流。扫描下图中二维码即可预约直播间:



LAMP


LAMP技术主要特点是用到4-6个特异性引物,利用链置换型DNA聚合酶(例如Bst酶)在恒温条件下进行扩增反应,可在15-60分钟内获得大量的扩增产物,是灵敏度和特异性都很高的扩增方法。迈迪安生物科技目前已经提供一系列性能优越的 Bst 聚合酶(包括无甘油可冻干的 Bst 酶)和免提取直扩的缓冲液。经很多客户验证,迈迪安的Bst酶具有比同类竞品更好的性能!


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正如前文提到的,在资源有限的条件下,对POCT检测的主要限制因素之一是保证检测试剂稳定性的冷链存储环节。为了解决这一难题,迈迪安公司今年重磅推出了可冻干LAMP和RT-LAMP一步法试剂,含有专门的冻干辅料和为冷冻干燥优化的缓冲液配方,可被冻干成粉状或粒装,适用于开发常温稳定的LAMP检测。冻干后的试剂具有稳定的保质期限和灵活的样本加样性, 可以被快速复溶,并且复溶后扩增性能仍然保持完整。


可冻干LAMP试剂(点击此处查看详情)


更值得一提的是,本月迈迪安全新推出的可冻干RT-LAMP一步法预混液,该产品是以单管形式提供,包含了RT-LAMP反应所需要的逆转录酶、Bst酶、优化的缓冲液和冻干辅料。它对低量样本和含有抑制物的样本均有较强的灵敏度,比同类竞品试剂反应更快速。并且,它的性能在冻干和常温储存后均不受影响,稳定性至少可达到1年。


RT-LAMP被广泛用于筛选多种病原体的POCT检测中,特别是RNA病毒,如流感病毒、轮状病毒、丙型肝炎病毒、西尼罗河热、登革病毒、埃博拉病毒,以及近年的SARS-CoV-2中。准确性和简单的设备让RT-LAMP成为病毒即时检测的完美解决方案,尤其是在一些非标准实验室场所,比如机场边防检疫和基层诊所等。该技术的应用不仅局限于人体诊断,还覆盖到兽医诊断,环境、农业和食品检测。


迈迪安可冻干RT-LAMP试剂的推出,为POCT平台提供了理想的解决方案,为检测厂商降低开发和生产成本的同时,还以优异的灵敏度和特异性超越市场同类产品。


可冻干RT-LAMP一步法试剂(点击此处查看详情)


qPCR


传统核酸诊断试剂盒的冷链运储一直都是难题,尤其是在资源有限的条件下,环境温度的多次变化造成试剂反复冻融,其性能也会因此大打折扣。为了更方便安全的存储和运输,常温稳定的干燥型试剂是一个很好的选择。它的优势包括可常温运输和储存,更长的保质期,以及样本体积更灵活。


qPCR试剂常见的干燥技术有冻干和风干,各有优势,可适用于不同诊断的需求。迈迪安提供的一系列不含甘油并使用专门冻干辅料配制的可冻干qPCR/RT-qPCR试剂,具有高灵敏度、高特异性以及较高的热稳定性,可兼容多种冻干设备制备成粒状或粉状,并且可理想地用于开发自动化高通量仪器上的多重检测。迈迪安目前已与国内外多家大型体外检测公司达成合作,该系列冻干试剂被用于多种获得国内外认证的新冠核酸试剂检测盒中,并且表现卓越。


分子诊断检测的趋势:可常温保存的冻干&风干qPCR技术 (点击此处查看详情)


除此以外,迈迪安还是全球首家推出一些列可风干的qPCR/RT-qPCR预混液,甚至可以用于免核酸提取的直接扩增,为开发常温稳定的干燥型检测提供了另一个选择。可风干试剂无需专业的冻干设备和技术,对操作环境也没有太高要求, 仅使用烘干箱即可进行干燥,操作简便快捷耗费低,并且通过风干干燥后的试剂性能不受影响。  特别是,最新研发的针对不同样本类型(血液、唾液或植物)抗抑性直扩可风干试剂,结合了迈迪安两大核心优势技术:抗抑性和可风干, 可成为冻干以外开发常温稳定、高灵敏度、低成本的分子POCT诊断的另一个理想选择。 


总结:LAMP和qPCR作为分子POCT的两大主要技术,各有优势。不可否认的是,常温稳定的干燥型检测是总体的趋势, 能解决POCT检测冷链运储的难题, 加快和扩大POCT应用的市场。迈迪安提供一系列性能优越的可冻干LAMP 和 qPCR试剂,是分子POCT诊断研发的理想解决方案。 


欢迎本周四(6月24日)晚上20点来到迈迪安直播间了解更多详情。





参考文献:

1.https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1201971221003295

2. https://www.mdpi.com/1422-0067/21/8/2826


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