循环肿瘤细胞CTCs检测技术及其临床应用

循环肿瘤细胞（CTCs）的概念于1869年由澳大利亚籍医生Ashworth首次提出，是指源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。可在肿瘤转移灶形成之前便以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTCs，也有聚集成团的细胞团，是恶性肿瘤转移的根源，因此通过CTCs检测捕捉检测外周血中痕量存在的CTCs，监测CTC类型和数量变化的趋势等，可在乳腺癌、肺癌、结直肠癌及前列腺癌等转移性实体瘤的微转移、监测术后复发、疗效评估与预后及个体化靶向治疗等方面发挥重要作用。

检测技术

研究表明：1 g肿瘤组织，大约有100万个肿瘤细胞，可每日播散肿瘤细胞入血。但是CTCs的数量在循环血液中常呈现出动态递减的特点，到达外周血时已十分稀少。在肿瘤病人10 mL 的血液里面大概仅含有1-10 个左右的CTC，所以在血液样本中收集罕见的CTC 并非易事。目前CTCs检测技术主要由两个关键部分构成：分离富集技术和鉴定分析技术。

其中CTCs分离富集技术包括密度梯度离心法（DGC)、细胞过滤技术（ISET）、免疫磁珠富集法、纳米基质分离技术和微流控芯片技术等。鉴定分析技术包括免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry，ICC）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、流式细胞术（Flow cytometry，FCM）和CTCs芯片技术（CTCs-Chip）等。

相关检测仪器

FDA在2004年、2007年和2008年分别批准了美国强生公司子公司Veridex开发的Cellsearch CTCs检测技术用于转移性乳腺癌、结直肠癌与前列腺癌的预后评估、无进展生存期和总生存期的预测。

目前专注于CTCs诊断的国内外企业包括强生Veridex公司、凯杰公司（Qiagen）、Epic Sciences、CytoTrack、Codiak BioSciences、Illumina、Thermo Fisher、美国Fluxion Biosciences公司、Celsee Diagnostics、莱尔生物医药，益善生物，立迪生物，珠海丽珠医药，上海格诺生物科技，海吉力生物有限公司、上海芯超生物、武汉友芝友医疗、宁波美晶医疗、上海浦美生物有限公司、华大智造推出的MGI EASYCELLTM系统、宝腾生物基于cellsearch系统的（CTC）检测平台等等。

三种代表性的循环肿瘤细胞检测仪器

1、 Cellsearch CTCs检测系统（Veridex公司）

目前唯一通过 FDA 批准，用于乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌的预后指标。该系统采用一种独创的称为铁磁流体的抗体，这种铁磁流体可同铁微粒相结合，且与CTCs表面的EpCAM+/CK+/CD45+等受体有极强的特异性结合的能力，系统用磁场将CTCs分离之后进行生物或化学染色，细胞表面具有EpCAM+/CK+/CD45+被识别为肿瘤细胞。

2、Celsee PREP检测系统

是美国Celsee Diagnostics公司生产的全自动循环肿瘤细胞富集和检测平台。其产品包括CTC富集和检测系列CelseePREP100 、Celsee PREP400以及图像分析仪Celsee ANALYZER。与其它免疫学与免疫磁珠、离心等富集分析方法不同，其而不依赖于特定的标志物，而是通过肿瘤细胞的物理特性来捕获富集。

3、CytoQuestTM

亚诺法（Abnova）推出的CytoQuestTM

CR是是用于循环罕见细胞 (CRC) 捕捉、计数、富集和收集的系统，以分子亲和力为基础，利用对温度敏感的奈米柱阵列捕捉及释放CTCs的平台。CytoQuestTM CR能够提供高纯度、高存活率的循环肿瘤细胞 (CTCs) 以进行后续的蛋白质生物标记（protein biomarker）辨识及基因分析

临床应用方向

目前主要应用于肿瘤的早期筛查，小创伤的检测肿瘤病理变化和预后疗效评估等方面。2010美国癌症联合委员会AJCC在2010年制定的《肿瘤分期指南》中，首次把CTC列入TNM分期系统，作为一个新的M分期（远端转移）标准，列为cM0(i+)分期，出现在M0和M1之间。2017最新版乳腺癌NCCN指南2017.v3版，正式引入cM0(i+)分期。2018年1月1日在全球启用的AJCC第八版癌症分期系统中，除保留cM0(i+)分期外，更进一步明确了CTC检测的临床价值。最新指南将CTC列为继ER/PR、HER2、Ki67和肿瘤组织学分级四项生物学指标之后的又一项乳腺癌预后评估工具，认为乳腺癌外周血中存在CTC提示预后不良。

1、研究表明，转移性乳腺癌患者在治疗前、治疗中和治疗后的CTCs水平均与其预后密切相关，CTCs可作为转移性乳腺癌患者独立的预后因子。

2、结直肠癌方面： CTCs检测主用是针对于上皮细胞EpCAM标志以及标志物CKl9、CK20、CEA等。早期患者外周血中就能检测到CTCs，提示CTCs检测对结直肠癌的诊断有所帮助。CTCs的存在与肿瘤原发灶分化程度无相关性，但与其临床分期具有相关性。

3、肺癌：在肿瘤直径小于0.1cm，其外周血中就可检出CTCs，可为肺癌的早期发现及诊断提供重要依据。并且外周血中循环肿瘤细胞存在以及数量与肺癌肿瘤分期具有相关性。在治疗方面，研究发现化疗前CTCs计数高的患者预后差，化疗后CTCs计数下降多的患者，化疗效果较好，死亡风险降低，提示CTCs对广泛期的小细胞肺癌具有预测作用，并且化疗后CTCs计数的改变可以提供有价值的临床信息，指导后续治疗。主要难点在于检测手段的灵敏性、特异性的问题。

4、关于胃癌：早期诊断、治疗胃癌是提高患者生存率的关键。研究发现CTCs阳性与胃癌淋巴结转移、远处转移和复发密切相关，胃癌早期阶段外周血中便可检出CTCs，提示可能在肿瘤早期阶段即发生微转移。

除此之外，在泌尿生殖系统肿瘤如前列腺癌，肾癌，膀胱癌等都是有力的预后工具，另外，在胰腺癌，脑癌方面，CTCs检测也在逐步涉及应用。

结语

作为液体活检主要部分，CTCs是目前研究的热点。具有无创、便捷、可重复性好的优点，但是检出率低，检测的灵敏性、特异性低成为限制其发展的瓶颈。其原因，首先和检测技术有关；其次和肿瘤类型、肿瘤大小、负荷和CTCs 半衰期有关，例如，大量CTCs从原发肿瘤部位进入循环血液等反复循环过程中，最后仅仅极少部分（0.02%）可以存活。

不过相信随着CTCs检测技术的改良进步，将在癌症患者早筛、全程治疗过程中发挥更加重要的作用。

癌症个体化的精准治疗的时代下，液体活检技术在癌症早筛方面表现出越来越明显的作用。

（转化医学网360zhyx.com）