新型CRISPR技术,基因敲除效率提高12倍,中科院神经所与上海交大合作Cell子刊重磅发文

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2018年5月21日，中科院神经科学研究所与上海交通大学医学院的研究人员合作在Developmental Cell上在线发表了题为“Tild-CRISPR Allows for Efficient and Precise Gene Knockin in Mouse and Human Cells"的研究论文。在这里，研究人员描述了一种方法，称之为tild-CRISPR(目标整合与线性化dsDNA-CRISPR)，一种靶向策略，其中用800bp同源臂的PCR扩增或精确酶切的转基因供体注射Cas9mRNA和sgRNA进入小鼠受精卵。与现有的靶向策略相比，该方法对小鼠胚胎和脑组织的敲除效率高得多。重要的是，Tild-CRISPR方法在人体胚胎中的基因敲除效率也比基于HR的方法高12倍，适合于研究体内基因功能和开发潜在的基因治疗方法。

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑极大地促进了修复细胞和组织的基因突变。然而，通过同源重组(HR)的精确敲除效率一般较低。最近，基于非同源末端连接(NHEJ)或微同源介导的末端连接(MMEJ)的方法报告说，在体内切割无同源臂(HA)或短HA(5-25 bp)的转基因供体时，促进CRISPR介导的斑马鱼和小鼠的靶向整合。此外，两组已经报道了一种基于同源介导的转基因供体体内切割策略(Hmej)，其中∼800 bp HA实现了强有力的DNA基因敲除。然而，在这种条件下的等位基因的小鼠以及DNA敲除蛋白修饰的人类胚胎，尚未通过这些新方法产生。据报道，利用长单链DNA(Ssdna)供体的靶向策略Easi-CRISPR可以高效地生成具有条件等位基因的小鼠。然而，Easi-CRISPR使用ssDNA作为供体是昂贵的，而且插入的大小也有限制(通常小于1kb)。

Tild-CRISPR介导的小鼠胚胎靶向整合

在这里，研究人员报告了一个Tild-CRISPR（与线性化dsDNA-CRISPR靶向整合）为基础的策略，采用PCR扩增的体外线性化DNA或800 bp HA的酶切转基因供体，有效地实现了小鼠和人胚胎以及小鼠体内的DNA靶向整合。

使用Tild-CRISPR生成Knockin小鼠

通过同源重组(HR)获得的基因敲除的靶向效率普遍较低。这里研究人员描述了一种方法，称之为tild-CRISPR(目标整合与线性化dsDNA-CRISPR)，一种靶向策略，其中用800bp同源臂的PCR扩增或精确酶切的转基因供体注射Cas9mRNA和sgRNA进入小鼠受精卵。与现有的靶向策略相比，该方法对小鼠胚胎和脑组织的敲除效率高得多。重要的是，Tild-CRISPR方法在人体胚胎中的基因敲除效率也比基于HR的方法高12倍，适合于研究体内基因功能和开发潜在的基因治疗方法。

原文链接：

https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(18)30327-7

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