推荐活动

专注生物医药求职招聘

Nature Biotechnology连发4篇CRISPR技术的文章,推动该领域跨越式的发展

首页 » 研究 2018-05-11 BioWorld 赞(2)
分享: 
导读
CRISPR已经应用于包含人类,小鼠,酵母,水稻等各个物种中,取得了空前的成功.就在近期,Nature Biotechnology 杂志连续推出...

CRISPR已经应用于包含人类,小鼠,酵母,水稻等各个物种中,取得了空前的成功。就在近期,Nature Biotechnology 杂志连续推出了4篇CRISPR技术的进一步升级应用,同时也进一步拓宽了CRISPR技术应用范围,尤其是为临床的应用做了非常好的铺垫。

这4篇文章分别是:美国伊利诺伊大学赵惠民研究组的'Genome-scale engineering of Saccharomyces cerevisiae with single-nucleotide precision"研究论文,该论文开发了一种CRISPR-Cas9和同源定向修复(HDR)辅助基因组尺度工程(CHAnGE)方法,该方法可以在酵母中快速产生数以万计的特定遗传变异;

美国斯坦福大学的“Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast”的研究论文,该论文在酵母开发可追踪基因组条形码的多重精确基因组编辑技术,该技术将广泛用于揭示酵母表型的遗传基础;

韩国首尔国立大学Kim研究组的“Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy”研究论文,该论文在小鼠胚胎中进行腺嘌呤碱基编辑及纠正杜兴氏肌营养不良症的成年小鼠,这是临床应用的前奏,具有非常大的应用价值;

上海科技大学陈佳研究组及黄行许研究组及上海生科院杨力研究组的“Base editing with a Cpf1–cytidine deaminase fusion”研究论文,该论文开发了一系列基于CRISPR-Cpf1的碱基编辑工具,它们能够以非常低的indel形式和非C-to-T替换进行有针对性的碱基编辑,并且可以在富含A / T的区域进行编辑。

1、美国伊利诺伊大学赵惠民研究组报告了一种CRISPR-Cas9和同源定向修复(HDR)辅助基因组尺度工程(CHAnGE)方法,该方法可以在酵母中快速产生数以万计的特定遗传变异

全基因组规模范围的工程技术能够通过并行生成全基因组突变来测试多种假设。现有的方法,如MAGE,TRMR和CREATE主要应用于细菌。虽然CREATE被证明在酵母中起作用,但原则上,没有报道高效,高通量的全基因组工程。一些现有的基因组规模方法的一个问题是,由于大肠杆菌不容易修复双链断裂,因此在经历了同源性定向修复的细胞的诱变过程中存在实质性的选择压力。在酵母中情况也不一样,迄今为止,高通量方法还没有被证明在全基因组范围内有效地工作。

真核生物MAGE(eMAGE)能够在酵母中进行全基因组规模范围的工程技术,但eMAGE的编辑效率依赖于靶序列与复制起点的紧密接近以及URA3标记的共同选择。虽然使用eMAGE进行全基因组规模范围的工程技术可能是可行的,但没有证明。美国伊利诺伊大学赵惠民研究组报告了一种CRISPR-Cas9和同源定向修复(HDR)辅助基因组尺度工程(CHAnGE)方法,可以在酵母中快速产生数以万计的特定遗传变异。 超过98%的靶序列被有效地编辑,平均频率为82%。该方法能够对基因组规模的酿酒酵母进行快速工程化,并进行精确和可跟踪的编辑。

原文链接:

https://www.nature.com/articles/nbt.4132

2、美国斯坦福大学研究人员在酵母开发可追踪基因组条形码的多重精确基因组编辑

我们对基因型控制表型的理解受限于我们可以精确地改变基因组并且评估每个扰动的表型结果的影响。在这里斯坦福大学研究人员描述了一种基于CRISPR-Cas9的方法,用于在酿酒酵母中使用短的,可跟踪的,整合的细胞条码(MAGESTIC)技术,进行多重精确基因组编辑。 MAGESTIC使用阵列合成的寡核苷酸进行基于质粒的高通量编辑,并具有基因组条形码整合功能,可防止质粒条形码丢失并实现稳健的表型分型。

研究人员证明,通过使用LexA-Fkh1p融合蛋白招募供体DNA至断裂位点,编辑效率可以提高五倍以上。研究人员对必需基因SEC14进行了饱和度编辑,并鉴定了对脂质信号传导的化学抑制至关重要的氨基酸。研究人员还构建了数以千计的天然遗传变异体,其特征在于基因组尺度上的引导错配耐受性。 MAGESTIC将广泛用于揭示酵母表型的遗传基础。

原文链接:

https://www.nature.com/articles/nbt.4137

3、韩国首尔国立大学Kim研究组在小鼠胚胎中进行腺嘌呤碱基编辑及纠正杜兴氏肌营养不良症的成年小鼠

由工程腺嘌呤脱氨酶和化脓性链球菌Cas9 nickase组成的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)以引导RNA(gRNA)依赖性方式,使腺嘌呤 - 鸟嘌呤(A-to-G)单核苷酸取代成为可能。 在这里,韩国首尔国立大学Kim研究组展示了这种技术在小鼠胚胎和成年小鼠中的应用。

Kim研究组显示,长的gRNA使腺嘌呤编辑在窗口上游的一个或两个碱基的位置处,可以用标准的单一向导的RNA(sgRNA)获得。 Kim研究组通过将ABE mRNA和延伸的gRNA微注射到小鼠胚胎中,在Tyr基因中引入Himalayan点突变,获得具有白化表型的Tyr突变小鼠。 此外,Kim研究组使用病毒载体将ABE(腺嘌呤碱基编辑器)基因递送至杜氏肌营养不良症小鼠模型中的肌细胞,以校正Dmd基因中的无义突变,从而证实了成年动物中碱基编辑的治疗潜力。

原文链接:

https://www.nature.com/articles/nbt.4148

4、上海科技大学陈佳研究组及黄行许研究组及上海生科院杨力研究组合作开发了一系列基于CRISPR-Cpf1的碱基编辑工具,它们能够以非常低的indel形式和非C-to-T替换进行有针对性的碱基编辑,并且可以在富含A / T的区域进行编辑

各种物种中,通过将 apolipoprotein B mRNA编辑酶,催化多肽样(APOBEC)或激活诱导的脱氨酶(AID)胞苷脱氨酶家族成员与CRISPR-Cas系统组合开发的碱基编辑已经用于靶向C对T碱基编辑【1-5】。然而,使用Cas9切口酶(nCas9)作为目前最活跃的BE中脱氨酶融合伴侣增加了不需要的插入和缺失(插入),非C-T碱基置换的频率,限制编辑富含G / C的PAM序列的区域【6,7】。

Cpf1(Cas12a)是另一种Cas蛋白,它与Cas9的不同之处在于:Cpf1需要富含T的PAM序列(TTTV)用于目标DNA的识别【8,9】; Cpf1(CRISPR RNA(crRNA))的sgRNA比Cas9短;并且Cpf1切割位点相对于间隔区DNA中的PAM序列位于远端和下游,而不是与Cas9的近端和上游【10,11】。与Cas9相比,Cpf1也诱导更少的脱靶(OT)切割基因组【12,13,14】。

为了解决以上问题,上海科技大学陈佳研究组及黄行许研究组及上海生科院杨力研究组合作通过将大鼠胞嘧啶脱氨酶APOBEC1融合到无催化活性的Lachnospiraceae细菌Cpf1上,开发了基于CRISPR-Cpf1的碱基编辑工具。 碱基编辑器可识别富含T的PAM序列,并催化人类细胞中的C至T转换,同时诱导低水平的插入缺失,非C至T替换和脱靶编辑。

该研究首次开发了一系列基于CRISPR-Cpf1的碱基编辑工具,它们能够以非常低的indel形式和非C-to-T替换进行有针对性的基础编辑,并且可以在富含A / T的区域进行编辑。 未来,预计其他Cpf1酶(例如,识别TTN PAM8的FnCpf1)或工程化的Cpf1 可用于进一步增强dCpf1的碱基编辑作用。

原文链接:

https://www.nature.com/articles/nbt.4102

参考文献:

1.Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Nature 533, 420–424 (2016).

2. Nishida, K. et al. Science 353, aaf8729 (2016).

3. Kim, K. et al. Nat. Biotechnol. 35, 435–437 (2017).

4. Zong, Y. et al. Nat. Biotechnol. 35, 438–440 (2017).

5. Li, G. et al. Protein Cell 8, 776–779 (2017).

6. Kim, Y.B. et al. Nat. Biotechnol. 35, 371–376 (2017).

7. Kleinstiver, B.P. et al. Nature 523, 481–485 (2015).

8. Zetsche, B. et al. Cell 163, 759–771 (2015).

9. Yamano, T. et al. Cell 165, 949–962 (2016).

10. Stella, S., Alcón, P. & Montoya, G. Nature 546, 559–563 (2017).

11. Swarts, D.C., van der Oost, J. & Jinek, M. Mol. Cell 66, 221–233.e224 (2017).

12. Kim, D. et al. Nat. Biotechnol. 34, 863–868 (2016).

13. Kleinstiver, B.P. et al. Nat. Biotechnol. 34, 869–874 (2016).

14. Yan, W.X. et al. Nat. Commun. 8, 15058 (2017).

(转化医学网360zhyx.com)

评论:
评 论
共有 0 条评论

    还没有人评论,赶快抢个沙发