“CRISPR-Cas9魔剪”失灵了？谷峰：三大操作问题或为脱靶“元凶”

近日，Nature Methods刊登一篇论文，来自哥伦比亚大学、斯坦福大学、艾奥瓦大学的研究人员通过WGS全基因组测序技术，检测到使用CRISPR技术治疗的小鼠产生上千个意外的基因突变，发生大量基因脱靶现象。该爆炸性文章立即引起业界高度关注和热烈讨论，也让备受推崇的CRISPR技术陷入短暂的“滑铁卢”。为此，贝壳社邀请了国家重点研发计划和国家自然科学基金项目评审专家，国内最早进行基因组编辑研究的科学家之一的谷峰博士作客线上沙龙，独家解读事件始末和真相缘由。

基因编辑技术发展历程

基因编辑，最早起源于荣获2007年诺贝尔生理医学奖的基因打靶技术。美国犹他大学医学院的马里奥-R-卡佩奇(Mario R.Capecchiand)、英国卡迪夫大学医学院的马丁-J-伊文思(Martin J.Evans)和北卡罗莱纳大学医学院的奥利弗-史密西斯(Oliver Smithies)三位科学家的一系列重大研究突破，让小鼠中的基因打靶技术得以问世。

小鼠基因打靶，是将一段外源序列插入小鼠胚胎干细胞中，替换小鼠胚胎干细胞的特定基因。由于该技术能实现基因定点改造，因而具有巨大应用潜力，对整个生命科学与医疗研究价值重大。但经典的基因打靶效率非常低，阳性概率是10-5~10-6，只有百万分之一，让学科发展受到严重阻碍。

后来发现新的基因编辑工具，锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)，是一种人工改造的核酸内切酶。锌指结构存在于大部分的转录因子蛋白中，能特异结合到基因启动子区，所以ZFN是锌指蛋白与核酸内切酶Fok1的融合产物，能在各种复杂基因组的特定位置切割形成双链切口。

该酶出现意义非凡，美国Sigma-Aldrich公司将ZFN技术商业化，推动了科研应用与发展。但由于ZFN仍有不少缺陷，比如结合DNA存在很强不确定性，5年后又诞生新一代基因编辑工具TALEN，它具有结构简单，特异性更高、成本低廉的优点，很大程度上替代了ZFN。TALEN技术灵感起源于抗病水稻，发现植物细菌蛋白TAL的氨基酸序列与靶位点的核酸序列具有一一对应关系，由此构建出能靶向定位的重组核酸酶TALEN。

2013年初，最新一代的人工核酸内切酶横空出世，它就是CRISPR/Cas9技术。当时美国两个实验室，MIT的华人科学家张峰和哈佛医学院的George Church的研究团队同时在Science上发文，证明CRISPR编辑能在真核细胞中发挥作用，由此奠定重要的应用研究基础。

文章发表后引起业内轰动，CRISPR-Cas9结构更简单，只需两个组件，Cas9蛋白和sgRNA序列，打靶的sgRNA引导Cas9核酸酶在基因组（包括iPS基因组）的特定位点上进行切割与修饰。DNA双链断裂后，自身会修复，如果有意人为引入修复模板，就能纠正特定基因。

因为操作简单，花费更少，CRISPR技术很快普及开来，在此基础上，全球实验室做了大量工作，分别从细胞系、动物水平以及iPS水平进行基因组的特定编辑，科研成果也相继发表在Science，Nature biology和Cells等知名期刊上。

现在，CRISPR/Cas9技术已分别在患有杜氏肌营养不良、B型血友病和PRKAG2心脏综合征的小鼠模型中成功发挥疗效，并在感染的哺乳动物乙肝细胞中删除了病毒DNA，这些实验的成功表明“CRISPR魔剪”有望治疗人类相关疾病。

实验操作细节或致小鼠上千基因突变

至于近期报道的基因编辑引发上千突变的热议文章，谷峰博士解释，该实验方法是为基因缺陷小鼠进行基因治疗，将疾病小鼠的受精卵取出来，注射Cas9蛋白，sgRNA是以质粒形式注射进去，外加修复模板。修复后采用全基因组测序方法进行检测，在两个小鼠体内发现1736个单碱基突变和1696个碱基突变。

这样操作有几个问题，一是行业公认做法是将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，得到转基因动物模型，但该实验是注射质粒形式的sgRNA，对此操作产生一点疑问；第二是注射受精卵后，因为受精卵会分裂很容易产生嵌合体，也容易产生错误结果。在遗传病治疗方面，一般很少用受精卵，受精卵仅用于科研，实际治疗中几乎无用。最后，靶点选择问题，如果不使用经典的PAM（NGG），敲除效率也会降低，而且注射剂量，如酶的过量使用都会造成脱靶。所以对于引发上千个基因突变的实验结果，研究人员应该认真分析实验设计与操作。

谷峰博士认为，降低脱靶率的策略还有寻找长序列PAM，提高保真力，选择高保真的Cas9并采用双缺口酶策略是目前解决脱靶的最好方案。

（转化医学网360zhyx.com）