利用Magnetic Luminex®High Performance Assay对血清中的人肾脏标志物进行多重测定

利用Magnetic Luminex^® High Performance Assay对血清中的人肾脏标志物进行多重测定
M. Anderson, M. Rynning, R. Fuerstenberg, G. Wegner, and J. Schmidt. | R&D Systems, Minneapolis, MN.

摘要

肾脏通过调节渗透压和血压，协助水和营养物质的再吸收，排泄废物和分泌激素，从而在生物体平衡中发挥重要的作用。肾功能对药物的代谢和排泄也很重要，因此，利用肾脏标志物来分析肾毒性是药物开发过程中一个重要的实验步骤。过去，肾功能是通过测定血清肌酸酐和血尿素氮水平来评估的。最近，一些更灵敏的肾脏标志物已被确定，包括TIM-1/KIM-1/HAVCR、Lipocalin-2/NGAL、Osteopontin、Cystatin C、Clusterin、CXCL10/IP-10、RBP-4、Fetuin A/AHSG和TFF3。我们利用Human Kidney Biomarker Magnetic Luminex Performance Assay，对10名健康个体、10名急性肾损伤（AKI）个体和10名被诊断为肾衰竭的个体的血清样本进行评估。我们观察到，与健康组相比，AKI组在Lipocalin-2、Osteopontin、Fetuin A和Cystatin C上存在统计学显著的差异；与健康组相比，肾衰竭组在TFF3、Lipocalin-2、Clusterin、Fetuin A和Cystatin C上存在统计上显著的差异；与肾衰竭组相比，AKI组的在统计上有显著的差异的标志物包括：TFF3、Fetuin A和Cystatin C。

R&D Systems公司的Human Kidney Biomarker Magnetic Luminex Performance Assay是专门为同时定量测定血清、血浆或尿液中的生物标志物而设计。

摘要

肾脏是在维持生物体内平衡发挥了多个重要作用的重要器官。在排泄废物以及水和营养物质的再吸收过程中，肾脏特别容易受到包括药物和代谢产物在内的有毒化合物的损伤。

肾功能受损可能是由急性肾损伤（AKI）或慢性肾病（CKD）引起的。AKI可能由外伤、败血症或药物毒性引起，而CKD可能是糖尿病、严重高血压、自身免疫性疾病或其他慢性疾病的并发症。过去，肾功能的评估主要依赖血压、血清肌酸酐、血尿素氮（BUN）、尿液中蛋白质与肌酸酐的比例、尿沉渣的测定以及肾小球滤过率（GFR）的改变。这些评估不是非常敏感，在AKI中可能有延迟，并且可能无法检测所有类型的慢性肾损伤。此外，在实验动物和人类中，可能存在有发生实质性的肾损伤但GFR测量不出变化的情况。

针对肾功能的特异生物标志物的鉴定一直是近期研究的热点。这些蛋白标志物的表达变化也许能应用于临床或临床前研究，以评估因肾毒性药物、局部缺血、败血症或肾移植而引起的AKI。特定的肾标志物还可以用于评估胚胎发育期间的肾脏发育。多重测定数个肾标志物可用于评估肾功能。

Luminex Performance Human Kidney Biomarker Panel是一个多重的免疫检测，可同时测定血清、血浆和尿液样本中的9种蛋白标志物：Clusterin、CXCL10/IP-10、Cystatin C、Fetuin A/AHSG、Lipocalin-2/NGAL、Osteopontin、RBP-4、TFF3和TIM-1/KIM-1/HAVCR。基础试剂盒可与9个分析物任意组合相匹配，为实验设计带来了更大的灵活性。利用完整的试剂盒，我们评估了10名患有AKI的个体、10名肾衰竭个体以及10名健康个体的血清样本。

方法

经诊断患有AKI或肾衰竭的个体的血清样本购自Bioreclamation。其他的血清样本从健康的内部捐献者中获得；无医疗信息参考。

我们利用Proteome Profiler™ Human Kidney Biomarker Array Kit（R&D Systems，货号ARY019）对两名外表健康的个体和两名肾衰竭个体的血清样本进行筛查。根据试剂盒操作说明中的适用于LI-COR Odyssey^® 近红外成像系统的NIR荧光检测的操作方法进行分析。

我们利用Luminex Performance Human Kidney Biomarker Magnetic Assay Kit（R&D Systems，货号LHK000）对10名健康的个体、10名AKI个体和10名诊断有肾衰竭的个体的血清样本进行检测。样本经过1:10和1:4000稀释，根据试剂盒的操作说明进行分析。

表1：Human Kidney Biomarker Magnetic Panel的性能特点

此试剂盒的检测与相应的Quantikine^® ELISA试剂盒有相关性，斜率在0.9-1.1，R² > 0.9。

图1. 利用Proteome Profiler Kidney Biomarker Array Kit检测38种蛋白质的相对表达差异。图中标识了对应于RBP4、Cystatin C、Lipocalin-2和TFF3的重复点样。(A) 表面健康个体的样本。(B) 肾衰竭样本。

图2. 利用Luminex Kidney Biomarker Magnetic Panel测定血清中的肾脏标志物。图中显示了每组10个样本的结果平均值和标准偏差。在所有检测的样本中均未检测到CXCL10/IP-10和TIM-1/KIM-1/HAVCR。

图3. AKI、CKD个体以及外表健康的捐献者的血清中肾脏标志物浓度的比较。在CKD和健康捐献者之间，Clusterin、Cystatin C、Fetuin A、Lipocalin-2和TFF3存在统计上显著的差异；在AKI和健康捐献者之间，Cystatin C、Fetuin A、Lipocalin-2和Osteopontin存在统计上显著的差异；而AKI和CKD捐献者之间，Cystatin C、Fetuin A和TFF3存在差异。穿过每个菱形的线代表组的平均值。每个菱形的垂直间距代表每组的95%置信区间。

讨论与结论

利用Proteome Profiler Human Kidney Biomarker Array Kit，我们发现，经诊断患有CKD的个体血清样本中所检测到的Cystatin C、Lipocalin-2、RBP4和TFF3水平，与外表健康的个体相比存在差异。作为此次筛查的结果，我们利用Luminex Performance Human Kidney Biomarker Magnetic Assay Kit对更多样本同时测定9种不同的蛋白标志物的浓度。我们发现，其中Clusterin、Cystatin C、Fetuin A、Lipocalin-2、Osteopontin和/或TFF3的浓度在AKI、CKD和外表健康的个体样本之间存在统计学显著的差异。RBP4的差异不显著。

结果表明，Luminex Performance Human Kidney Biomarker Magnetic Assay Kit是药物毒性研究的一个可靠且高效的工具，因为它能同时评估单个样本中9种肾脏标志物的水平。

参考文献：

1. Mehta, R.L. et al. (2004) Kidney Int. 66:1613.

2. Ozer, J.S. et al. (2010) Nat. Biotech. 28:486.

3. Bonventre, J.V. et al. (2010) Nat. Biotech. 28:436.

4. Goodsaid, F.M. et al. (2009) Clin. Pharmacol. Ther. 86:490.

5. Vaidya, V.S. et al. (2010) Nat. Biotech. 28:478.

6. Dieterle, F. et al. (2010) Nat. Biotech. 28:455.

（转化医学网360zhyx.com）