中国分子诊断的现状及应用前景

钟蔚女士，硕士，中山大学达安基因股份有限公司战略投资部经理；何蕴韶先生，教授、博士生导师，中山大学达安基因股份有限公司董事长。

<br/><strong>关键词: 分子诊断 基因诊断 人类基因组</strong><br/>


<br/><strong>一 中国分子诊断技术的进展
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　　分子诊断技术是将分子生物学原理和技术应用于疾病实验诊断而产生的一门新兴的检验医学技术，是当代医学发展的重要前沿领域之一，其核心是基因诊断技术。
　　中国的分子诊断技术在20世纪60~70年代开始萌芽，80年代出现以核酸探针的放射性核素标记、点杂交、Southern印迹杂交和限制性片段长度多态性连锁分析为代表技术的分子诊断技术萌芽。最早关于分子诊断的研究报道是1983年由中国医学科学院等单位完成的对a地中海贫血的产前基因诊断。此后，北京、上海、广州等地的一些研究单位开始陆续建立了地中海贫血、苯丙酮酸尿症、血友病、杜兴氏肌营养不良、G-6-PD缺乏症等几个常见遗传病的分子诊断方法。但在整个80年代，分子诊断的概念尚未被普遍接受，分子诊断技术尚未从大学、研究所走向临床实验室。

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　　20世纪90年代，由于PCR技术的推广应用，分子诊断技术在中国得到了较快发展，开始进入临床实验室。除单基因遗传病外，肿瘤、感染性疾病、基因多态性、多基因遗传病等也被纳入分子诊断的范围，几乎所有的实验方法都建立在PCR的基础上。但在90年代中期，中国分子诊断技术发展出现了一个严重的偏向：PCR技术在临床实验室的滥用。所幸这一偏向在90年代后期得到了纠正，分子诊断技术回到了理性发展的轨道。90年代后期以来，中国的分子诊断技术呈现出三个主要发展动向：第一，伴随着中国人类基因组计划的启动(1994年)以及中国对国际人类基因组计划的正式参与(1999年)，分子诊断开始从关注单个基因转向关注整个人类基因组；第二，PCR的定量化及其应用；第三，基因芯片技术的开发和兴起。目前，分子诊断在实验诊断市场中占的份额还很小，但增长得十分迅速，未来10年内，分子诊断技术将在实验诊断中起主导作用。

<br/><strong>二 分子诊断的应用
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1. 传染性疾病分子诊断
　　导致传染性疾病的病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等病原体的传统检测方法通常采用形态学检查、体外培养和免疫学试验。但对某些难以培养的病原体，抗原抗体检测不能判断体内病原体DNA或RNA的复制情况，或存在检测灵敏度低等问题。而采用分子诊断，正可以解决上述瓶颈问题，实现如下功能：
　　(1) 发病前预防：分子诊断技术可直接检测基因的突变，对临床可疑的患者予以鉴别诊断，进一步阐明发病的分子遗传基础；
　　(2) 快速检测细菌感染：如结核杆菌和其它结核蜡样杆菌、军团菌、立克次体、衣原体等的DNA鉴别，彻底改变了过去生长周期长，检出率低的传统培养手段；
　　(3) 快速诊断病毒感染：如HIV、HCV、HBV及2003年春季出现的传染性非典型性肺炎(SARS)的快速诊断，防止其暴发流行；
　　(4) 提供治疗依据：对于耐药型致病菌的DNA分型可提供治疗依据；
　　(5) 发现新病种：从微生物核酸的扩增和测序过程中发现了许多从培养基和显微镜中找不到的病原体，从而获得了过去不能想象的证据。
　　目前我国急需检测的传染性疾病为：
　　a. 肝炎
　　中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”，根据《2006年中国卫生事业发展情况统计公报》，病毒性肝炎发病率居传染性疾病发病率首位。我国总人口中至少有7亿多人已感染过甲肝，6亿多人已感染过乙肝，约1.3亿人携带乙肝病毒。全国每年发生急性病毒性肝炎约140万例，同时在我国现有2000万慢性乙肝患者。每年约有28万人死于与乙肝相关的疾病。粗略估算，我国每年用于肝炎对症治疗的直接医疗费用超过1000亿元人民币。特别是乙肝，已成为因病致贫、因病返贫的一个重要原因。
　　在确定肝炎病毒是否复制及抗病毒治疗监测方面，分子诊断技术中的荧光定量PCR(FQ-PCR)具有很好的指导意义，是目前在国内应用最广泛的病原体分子诊断项目。在母婴传播的监控中，FQ-PCR技术能快速、准确检测孕妇血液中HBV-DNA的数量，医生可及时对患者进行诊断治疗，从而大大降低通过母婴传播HBV病毒的几率。耐药突变监测是分子诊断的另一重要用途。抗病毒治疗是慢性乙型肝炎的根本治疗方法，基本治疗目标是清除或永久抑制乙型肝炎病毒的复制，降低致病性和传染性，消除或减轻肝脏的炎症和坏死。耐药突变监测在乙肝抗病毒治疗全程都起着不可忽视的辅助作用。
　　b. 艾滋病及性病
　　到2001年9月底，全国各省、自治区、直辖市共报告HIV感染者28133例，其中艾滋病病人1208例，死亡641例。根据专家估计，截止到2002年底，我国艾滋病实际病毒感染者已达100余万。与此同时2001年全国共登记报告性病病人83.6万人，比上年上升30%多。据专家估计，中国实际性病患者数在600~ 800万之间。作为流动人口聚集的大城市北京，性病增长率更是超过40%以上。
　　1996年国务院成立防治艾滋病性病协调会议制度，1998年印发《中国预防与控制艾滋病中长期规划(1998~ 2010年)》，2001年卫生部等30个部委共同制定《中国遏制与防治艾滋病行动计划(2001-2005)》，国家财政部为此决定每年从中央财政部拨1亿元用于艾滋病防治工作。
　　HIV感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关，甚至可根据HIV的量准确预测发病时间。病毒载量也是预测异性恋伴侣间HIV传播风险的主要因素，在HIV-RNA水平小于1500拷贝/mL时，HIV的传播很少发生。因此，分子诊断中的FQ-PCR定量诊断技术在目前艾滋病诊治过程中的作用至关重要。
2. 遗传性疾病分子诊断
　　a.优生优育
　　分子诊断在遗传性疾病中，如地中海贫血、血友病携带者，及产前诊断优生优育有着重要的作用。人口统计显示，我国每年出生2000多万新生儿。根据出生缺陷监测和残疾儿调查结果显示，我国是出生缺陷高发国家，每年有近100万出生缺陷儿发生，30%在出生前后死亡，40%造成终生残疾，只有30%可以治愈或纠正。在这些出生缺陷儿中，80%是由于遗传因素造成的。研究表明，孕妇宫内感染弓形虫TOX、风疹病毒RV、巨细胞病毒CMV、单纯疱疹病毒HSV等病原体有可能引起胎儿发育异常。实时FQ-PCR可检测孕妇羊水标本中病毒载量，作为是否终止妊娠的辅助指标。如果能对这些患儿进行症状前诊断或产前诊断，给予及时而适当的治疗和预防，其经济和社会效益是不言而喻的。
　　目前我国几个主要的医学遗传中心能检测的分子诊断项目有20多种，包括唐氏综合征、13三体综合征(又称Patau综合征)、18三体综合征(又称Edwards综合征)、地中海贫血、甲型血友病、进行性肌营养不良、苯丙酮尿症、脆性X综合征、马凡氏综合症、Prader-Willi综合征、脊髓性肌萎缩症、软骨发育不全、亨廷顿舞蹈病、结节性硬化症、特发性无精症、两性畸形、成人型多囊肾病、粘多糖贮积症Ⅱ型、遗传性视神经病、成骨不全Ⅰ型、视网膜色素变性等。
　　b. 糖尿病
　　目前中国糖尿病患者已经超过3000万人，居世界第二位。世界卫生组织估计，至2025年，中国糖尿病人将达5000多万。至2001年底，中国糖尿病发病率为3.6%，其中90%以上为Ⅱ型糖尿病。中国糖尿病患者每年造成的医疗费用开支高达1700多亿元人民币，而且这种疾病通常是终身性的，巨额开支会给国家经济带来沉重负担。分子诊断可通过发现糖尿病蛋白标志物实现疾病早期诊断和监控，降低疾病危害。
3. 肿瘤分子诊断
　　目前，我肿瘤患者人数超过了450万，居世界首位，每年新发癌症病例160~200万，近130万人死于癌症，癌症死亡率已占死亡人口的1/5，在致死的各类病因中，肿瘤在城市和农村中均已上升至第一位。
　　目前肿瘤的治愈率仍不高，主要原因就是早期诊断及正确选择化疗药物敏感性存在较大困难．因此造成到医院确诊的癌症患者，85%属晚期，70%以上已有远处转移，因而肿瘤的早期发现和诊断对肿瘤的预防和治疗至关重要。分子诊断技术中的肿瘤标志在诊断肿瘤、检测肿瘤复发与转移、判断疗效和预后以及人群普查等方面都有较大的实用价值。肿瘤标志可分为基因标志和基因表型标志。基因标志是指基因本身突变和表达异常，能反映癌前启动阶段的变化；基因表型标志是指基因产物表达和调控异常，表现为其所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原、异位蛋白，一般出现较晚。因此，寻找特异性肿瘤基因标志进行肿瘤分子诊断，对于肿瘤早期发现具有重要意义，并可在患者临床症状出现以前预测肿瘤的易感性。
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三 中国分子诊断的前景
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　　中国是个人口大国，分子诊断在中国具有广阔的应用和发展前景。以传染性疾病的分子诊断为例：根据《2006年中国卫生事业发展情况统计公报》的统计，目前中国有三级医院1045个(其中：三甲医院647个)，二级医院5151个。平均一家三级医院每年检测30000份样品，一家二级医院年检测5000份样品。如果使用传统细菌培养和ELISA技术检测，每份样品收费约100元人民币，每一项化验通常只能确定一种病原体，需3~7天才能得到结果；如果在人力和设备资源可以完成分子诊断的二、三级医院中采用分子诊断技术，不仅可在1天内完成检测，且平均每份检测的成本可控制在50元左右，从社会效益来看，发展分子诊断对传染性疾病的预防控制，除快速准确外，至少可以节约20亿的成本，其重要性可见一斑。
　　我国近年在分子诊断技术的发展上不断突破，政府起了非常重要的推动作用。我国卫生部、总后卫生部提出的“新发传染病等防治技术研究与应用”项目作为“十五”国家科技攻关计划重大项目组织实施，重点开展传染病的快速筛查、检测、分离、鉴定、追踪、预警、诊断、治疗等方法和技术的研究，整体提高应对传染病的科技水平和能力。在北京小汤山百善镇已集中建设新的国家疾控中心(CDC)，各地对各级CDC也投入大量经费，以整体提高各级CDC对目前日益严峻的疾病预防控制形式的应对能力。
　　根据全国防治SARS科技攻关工作的统一部署和专家评审意见，973批准了“SARS病毒比较基因组学及分子进化研究”等31个课题立项；国家科技部九五重点攻关项目“常见病原体新型核酸扩增(PCR)技术研究及产业化”，由北京医科大学、中山医科大学等单位承担；2005年，中国科学院广州生物医药与健康研究院组织开展的“核酸快速等温检测技术”科研项目取得进展，并正在应用此技术开发用于禽流感的快速诊断试剂盒。2005年，达安基因研究成功的“荧光定量PCR基因诊断技术”，该技术的发明和应用使得基因诊断试剂国产化达到了95%以上，也使基因诊断价格大幅度降低。
　　此外，截止到2006年底，全国已有1451个县(市、区)开展了新型农村合作医疗，覆盖人口为5.08亿人，4.10亿农民参加了合作医疗，参合率为80.7%。随着乡镇农村医疗开展，对分子诊断技术也提出了新的挑战——现有分子诊断对操作人员和设备、使用环境要求相对较高。简单、快速、便于普及的快速诊断正随着农村合作医疗的深入开展，成为分子诊断的另一个趋势。
　　展望未来，中国的分子诊断将面临以下几个方面的挑战：
　　(1) 分子诊断临床应用的规范化；
　　(2) 分子诊断向常规临床诊治工作的渗透；
　　(3) 遗传咨询和基因检测的伦理问题；
　　(4) 基因芯片的实用化、全基因组范围的检测和筛选；
　　(5) 具有我国自主知识产权的分子诊断技术的建立；
　　(6) 简单、快速、便于普及的快速分子诊断的开发。
　　随着人类基因组计划和后基因组计划的实施，中国分子诊断技术在应对上述挑战的同时也将得到进一步的成熟和完善。而正是分子诊断的不断发展，正在使国人从注重疾病诊治到注重生命全过程的健康监测，重预防、治未病，从而提高我国整体人口与健康科技水平。

<br/>来源：《世界医疗器械》