【行业动态】细菌耐药新关注丨首家抗生素抗性基因检测（qPCR篇）

抗生素，大家对它都不陌生，它的主要作用是抑制细菌的生长，治疗细菌在体内的感染，但是抗生素也有毒副作用，一是可能产生过敏反应(危及生命)，二是增加细菌的环境选择压力，对细菌进行筛选，使其耐药性增强。因此绝对不能乱用抗生素。

然而，自第一支青霉素出现之后，抗生素的种类逐年增加，抗生素用量和使用范围也不断增大。抗生素使用过量、不足、错用的问题在日常生活中大量存在，不仅导致在医疗业中出现了很多耐药的致病菌，而且也造成了自然环境中细菌耐药性的大幅增长和广泛传播。细菌耐药的问题已成为全球共同的问题。

微分基因首家推出的抗生素抗性基因检测(ARGs)，可以检测的ARGs种类多，形式灵活多样，通量大，周期短，性价比高。

今天小编给大家介绍一下使用qPCR进行ARGs的检测的流程。抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）的增多是细菌产生耐药性的直接原因，qPCR作为基因定量重要技术手段，在ARGs的检测方面应用十分广泛。

实验目的

检测环境样本中ARGs的种类、丰度及与样本的相关性。

样本选取和准备

根据研究目的，选取特定环境的土壤、水体、粪便、空气等样本，提取全部细菌DNA进行后续实验。

注意：DNA中杂质对于qPCR影响较大，需尽量去除杂质，建议在不影响最终实验需求的情况下增加洗脱次数。

确定基因及设计引物

确定好具体要检测的ARGs之后，计算qPCR的反应个数，公式如下：

qPCR反应数=引物数量×样本数量×技术重复数（一般为3）+空白对照

注意：由于是微生物样本，可设置16S基因作为内参，亦可采用其他已知微生物都存在的序列作为内参，以进行后续的相对定量计算^[1]

qPCR仪的选取

传统qPCR仪（图1）以96孔，384孔为主，适合反应数量较少、样本DNA量较高的实验，反应体系为μl级别，若用于大量样本的多引物qPCR检测，则成本较高，操作流程复杂，易产生人工操作误差。

由于ARGs种类丰富，常常需要上百个基因同时进行检测，传统qPCR仪器已不再适合。WaferGen Smartchip超高通量qPCR平台（图2），可同时进行5184个qPCR反应，全自动化加样系统，100nl反应体系，很好的解决了高通量、均一性、样本需求量的问题。

图1赛默飞实时荧光定量PCR系统

图2 WaferGen Smartchip超高通量qPCR平台

表1 WaferGen平台与普通qPCR平台对比

WaferGen平台加样模式灵活，可以根据基因数量和样本数量进行调整，确保性价比最高。

表2 WaferGen平台加样模式

qPCR数据处理

生物信息学分析

图3 ARGs分类统计^[2]

图4 样本间ARGs关联性circos图^[2]

图5  ARGs聚类热图^[2]

以上就是使用qPCR进行ARGs的检测流程。

参考文献：

1 Chen Q, An X, Li H, et al. Long-term field application of sewage sludge increases the abundance of antibiotic resistance genes in soil[J]. Environment International, 2016, 92-93:1.

2 Wang F H, Qiao M, Su J Q, et al. High throughput profiling of antibiotic resistance genes in urban park soils with reclaimed water irrigation.[J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(16):9079-85.

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