测序技术新突破：新纳米孔通过电流变化检测DNA序列

在个体化医疗前景的诱惑下，研究人员将研发出更有效的基因测序新方法视为首要任务。如今，宾夕法尼亚大学物理学家利用固态的纳米孔区分单链DNA分子，这一有前景的技术，在DNA穿过纳米孔时，通过检测电流变化进而读取DNA序列。相关研究发表在《ACS Nano》期刊上。

领导这项研究的是艺术与科学学院物理学和天文学系的副教授MARIJADrndić，参与者包括研究生Kimberly Venta 和 Matthew Puster，博士后研究员Gapiel Shemer、Julio A. Rodriguez-Manzo和Adrian Balan。他们连同布朗大学Jacob K. Rosenstein副教授和哥伦比亚大学教授Kenneth L. Shepard进行合作。

这一称为DNA转运测量的技术让DNA链（溶解在盐溶液中）在施加电场条件下被驱动穿过开口膜，当DNA链上的每一个碱基穿过孔时，同时它会阻止一些离子通过；纳米孔芯片上的信号放大器能记录电流由此而导致的下降。由于每个碱基在体积上各不相同，研究人员希望能利用电流数据推测出碱基序列，但是考虑到碱基体积差异小，纳米孔和膜片两者的面积需要接近DNA链本身，这是一个很大挑战。

在测序领域最接近商业应用的纳米孔设备取材于蛋白质孔和磷质双分子层，其中蛋白质孔具有理想面积，而那些磷脂双分子膜像肥皂膜一样，在耐用性和稳定性上有待改进。

较易转运以及整合电子元件的固态纳米孔设备(由固态薄片制成)优越于相同功能的生物学纳米孔，但是它在检测不同碱基灵敏性上具有进展相对较慢的基础原理验证。

Drndić 称：“虽然生物学纳米孔已证实能测序单核苷酸链，但是我们仍致力于解决不利于固态纳米孔设备发展的两大挑战：制造体积合适的纳米孔以及实现信号强、低噪声和片段长短幅度大的测试。”

纳米孔区分不同碱基的机制是碱基阻塞的孔径大小，因此，孔径越小，准确性会越高。对于那些能有效测序碱基的纳米孔，它的直径必须接近DNA的，其厚度必须接近相邻碱基的长度，约为0.3纳米。

为了获得面积微小的固态纳米孔和膜片，研究人员（包括Drndić小组在内）利用石墨烯等尖端材料。在六角形晶格的石墨烯膜片中，单层碳原子在宽度上能窄到0.5纳米，不过其缺点还有待解决，例如，这种材料本身具有疏水性，让DNA链很难通过。

Drndić和同事在研究中利用不同材料（氮化硅）去研制纳米孔，这一材料经过处理后具有亲水性，能够让DNA很容易进行移位（过去的十年内其他研究人员已证实）。此外，新研制的膜具有约5纳米的厚度，不过在纳米孔上特定方法可让氮化硅像石墨烯一样薄。

Drndić和同事利用氮化硅纳米孔重复测试同一碱基的单一DNA链，能明确检测的是三个碱基（腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶），而另一碱基鸟嘌呤组成同聚序列后很难通过纳米孔。

Drndić称：“我们发现：这些微孔敏感于碱基种类；直径为1或2纳米的孔都能产生同样结果，这一结果表明不同的制作方法是允许的。”

以单分子实时测序为代表的第三代测序技术

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其核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次掺入ACGT。随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+ 的检测，实时判读碱基。

Ion Torrent 半导体测序芯片的每个微孔里微球表面含有大约100 万个DNA 分子拷贝。测序时一个个核苷酸分子连续流过芯片微孔。如果核苷酸与特定微孔中的DNA 分子互补，则该核苷酸被合成到DNA 分子中，并且释放氢离子，该孔溶液的PH 发生变化。离子传感器检测到PH 变化后，即刻便从化学信息转变为数字电子信息。如果DNA 链含有两个相同的碱基，则记录电压信号是双倍的。

如果碱基不匹配，则无氢离子释放，也就没有电压信号的变化。这种方法属于直接检测DNA 的合成，因少了CCD 扫描，荧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。

>>Pacific Bioscience公司PacBio RS

该测序仪的工作原理是，将基因组的DNA断开成许多很小的片段，这些小DNA片段制成溶液后滴入测序仪内的金属薄片上，金属薄片中分布着3000个纳米级小孔，这些纳米孔的直径不到70纳米，被滴入薄片上后，小DNA片段会分散到不同的纳米孔中。每个纳米孔中涂有一种特殊的酶——DNA聚合酶，DNA聚合酶的特性是，能够沿着DNA片段的双链结构游动，在游动的过程中将DNA片段的双链结构打开，分成两个片段，也可为某个DNA单链找到对应的片段，重新组合在一起，科学家将DNA聚合酶的作用形象地比喻成衣服的拉链，可开可合。

测序仪就是利用DNA聚合酶来“窃取人类的自然本性”的。一旦DNA片段在纳米孔中分散完毕，向聚合酶分子滴入经过特殊处理的核苷酸溶液，谜底就会被揭开。核苷酸溶液中的每个核苷酸都用磷光染色剂做过标记，金属薄片的底部也有一个缩微版光谱仪，一旦DNA片段中有核苷酸与之配对，标记物就会发出特定颜色的光，缩微版光谱仪就能检测并记录下这些闪光，测序仪从而记录下每个DNA片段中的碱基对顺序。当闪光记录完之后，结果会输入计算机中，计算机破译出所有的DNA片段结果，并重新“组装”，让基因组恢复原样。

原文链接：

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Differentiation of Short, Single-Stranded DNA Homopolymers in Solid-State Nanopores

In the last two decades, new techniques that monitor ionic current modulations as single molecules pass through a nanoscale pore have enabled numerous single-molecule studies. While biological nanopores have recently shown the ability to resolve single nucleotides within individual DNA molecules, similar developments with solid-state nanopores have lagged, due to challenges both in fabricating stable nanopores of similar dimensions as biological nanopores and in achieving sufficiently low-noise and high-bandwidth recordings. Here we show that small silicon nitride nanopores (0.8- to 2-nm diameter in 5- to 8-nm-thick membranes) can resolve differences between ionic current signals produced by short (30 base) ssDNA homopolymers (poly(dA), poly(dC), poly(dT)), when combined with measurement electronics that allow a signal-to-noise ratio of better than 10 to be achieved at 1-MHz bandwidth. While identifying intramolecular DNA sequences with silicon nitride nanopores will require further improvements in nanopore sensitivity and noise levels, homopolymer differentiation represents an important milestone in the development of solid-state nanopores.


来源：生物探索